肝特异性构建体、因子VIII表达盒及其使用方法技术

本发明专利技术是处于基因疗法的领域中，具体地是将编码转基因的构建体靶向递送至肝以用于表达有益的(治疗性)蛋白质。具体地说，本发明专利技术涉及血友病诸如甲型血友病的治疗。本发明专利技术描述用于在肝细胞中表达转基因的组合物和方法。所述转基因可以在染色体外(以游离基因形式)表达或者可以整合到所述肝细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述转基因编码参与凝血级联的蛋白质。在优选的实施方案中，所述转基因编码FVIII多肽。FVIII多肽。FVIII多肽。

【技术实现步骤摘要】
肝特异性构建体、因子VIII表达盒及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2015年10月28日提交的美国临时专利申请号62/247,469；2016年3月14日提交的美国临时专利申请号62/307,897；2016年4月22日提交的美国临时专利申请号62/326,229；2016年3月30日提交的美国临时专利申请号62/315,438；以及2016年6月27日提交的美国临时专利申请号62/355,106的权益，所述申请特此全部以引用的方式整体并入。


[0003]本公开是处于基因疗法的领域中，具体地是将编码转基因的构建体靶向递送至肝以用于表达有益的(治疗性)蛋白质。具体地说，本公开涉及血友病诸如甲型血友病的治疗。
[0004]背景
[0005]基因疗法可以用于将细胞遗传工程化以具有一个或多个失活基因和/或使得该细胞表达先前该细胞中未产生的产物(例如，经由转基因插入和/或经由校正内源序列)。转基因插入的使用实例包括插入编码一种或多种新型治疗性蛋白质的一种或多种基因、插入编码细胞或个体中缺少的蛋白质的编码序列、在含有突变的基因序列的细胞中插入野生型基因和/或插入编码结构性核酸诸如微小RNA或siRNA的序列。内源基因序列的
‘
校正
’
的有用应用的实例包括疾病相关基因突变的改变、编码剪接位点的序列的改变、调控序列的改变和/或编码蛋白质的结构特征的序列的靶向改变。
[0006]肝基因转移提供将转基因递送至受试者以用于治疗和/或预防不同病症(包括血友病和溶酶体贮积病)的有效方式。参见，例如，美国专利号9,150,847以及美国公布号20130177983和20140017212。还已描述对肝定向基因疗法具有特异性的载体。参见，例如，WO2014064277；WO 2009130208；EP 2451474B1；Chuah等人，(2014)Molecular Therapy,22,1605
‑
1613；以及Nair等人,(2014)Blood123:3195
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3199。这些载体可包括野生型小鼠微小病毒(MVM)内含子序列。参见，例如，Haut和Pintel(1998)J.Virol.72:1834
‑
1843；Haut和Pintel(1998)Virol.258:84
‑
94。
[0007]在完整哺乳动物中，存在可以调控免疫系统的细胞成员的活化或抑制的复杂机制。例如，树突状细胞(DC)已确立为在免疫活化对比免疫耐受之间的平衡中的重要参与者。它们是免疫系统中最强效的抗原呈递细胞并且将抗原特异性捕获并呈递到原初T细胞。不成熟DC通过特异性受体诸如Toll样受体与潜在抗原相互作用，其中所述抗原通过微胞饮现象进入细胞。抗原然后被分解成更小的肽，所述肽通过主要组织相容性复合物呈递至T细胞。另外，成熟DC分泌炎性介质，诸如IL
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1β、IL
‑
12、IL
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6和TNF，所述炎性介质进一步用于活化T细胞。在另一方面，DC也起到使身体对一些抗原耐受以便维持中枢和外周耐受的作用。致耐受性DC(tolDC)在细胞表面上具有少量共刺激信号并且具有减少的以上所述炎性介质的表达。然而，这些tolDC表达大量抗炎性细胞因子像IL
‑
10并且当这些细胞与原初T细胞相互作用时，驱使所述T细胞变成无变应性/调控性T细胞(CD8+Treg)。实际上，已显示此过程在用这些不成熟/致耐受性DC重复刺激T细胞后有所增强。还已鉴别若干因子，所述因子与
tolDC协同作用以诱导不同类型的Treg。例如，原初T细胞与tolDC和HGF、VIP肽、TSLP或维生素D3共同暴露导致对CD4+CD25+Foxp3+Treg的诱导，与TGF
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β或IL
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10的共同暴露导致Tr1 T reg并且与糖皮质激素、雷帕霉素、视黄酸共同暴露可以导致CD4+/CD8+Treg(Raker等人(2015)Front Immunol 6:art 569以及Osorio等人(2015)Front Immunol 6:art535)。
[0008]血友病诸如甲型血友病和乙型血友病是凝血系统的遗传病症，其特征是出血至关节和软组织中以及过量出血至经历创伤或经历手术的任何位点。甲型血友病在临床上与乙型血友病难以分辨，但是因子VIII(FVIII或F8)在甲型血友病中缺乏或缺少，而因子IX(FIX或F.IX)在患有乙型血友病的患者中缺乏或缺少。F8基因编码与无活性形式的冯威勒布兰特氏因子(von Wilebrand
’
s factor)相缔合来循环的血浆糖蛋白。在表面损伤后，内在凝血级联启始并且FVIII从复合物中释放并且被活化。活化形式与因子IX一起作用来激活因子X变成活化Xa，最后导致纤维蛋白原改变至纤维蛋白和凝结诱导。参见，Levinson等人(1990)Genomics 7(1):1
–
11。40％
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50％的甲型血友病患者具有涉及F8内含子22的染色体倒位(也称为IVS22)。倒位的原因是F8基因的内含子22中的9.6kb序列与位于F8基因远侧约300kb处的两个密切相关反向序列中的一个之间的染色体内重组事件，导致相对于外显子23至26的外显子1至22倒位。参见，Textbook of Hemophilia,Lee等人(编辑)2005,Blackwell Publishing。其它甲型血友病患者在F8中具有缺陷，包括活性位点突变，和无义和错义突变。
[0009]在临床上，甲型血友病患者根据患者发生出血发作的频率和那些发作持续的时间长短来评价和分等级。这两种特征直接取决于患者血液中的FVIII蛋白质的量。患有严重血友病的患者通常具有小于1％正常血液水平的FVIII，经历损伤后出血并且常常自发出血到其关节中。中度患者具有1％
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5％正常FVIII水平，而轻度患者具有6％或更多正常FVIII并且仅在严重损伤、创伤或手术之后发生出血发作(Kulkarni等人(2009)Haemophilia 15:1281
‑
90)。患有甲型血友病的患者用源自人类血浆或重组产生的替代性FVIII蛋白质治疗，其中治疗的频率取决于出血模式和血友病的严重性。患有严重甲型血友病的患者定期地接受预防性治疗以预防出血发生，而较不严重患者可以仅在损伤后按需要接受治疗。
[0010]已经描述患有甲型或乙型血友病的患者的基因疗法，其涉及引入编码功能性FVIII或F.IX蛋白质的质粒和其它载体(例如，AAV)。(参见，例如，美国专利号6,936,243；7,238,346和6,200,560；Shi等人(2007)J Thromb Haemost.(2):352
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61；Lee等人(2004)Pharm.Res.7:1229
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1232；Gr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸表达构建体，其包含含有绝缘子序列的至少一个间隔子序列、肝特异性增强子序列、启动子序列以及转基因。2.如权利要求1所述的多核苷酸表达构建体，其还包含内含子序列，其中所述增强子序列包括野生型或突变的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白1增强子；和/或所述启动子序列包括野生型或突变的甲状腺素运载蛋白(TTR)启动子；和/或所述内含子序列包括野生型或突变的小鼠微小病毒(MVM)内含子序列。3.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸表达盒，其中所述绝缘子序列是SEQ ID NO:28、29和/或30中的任一个。4.如权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸表达盒，其包含侧接所述肝特异性增强子序列、所述启动子序列、所述内含子序列和所述转基因的两个间隔子序列。5.如权利要求4所述的多核苷酸表达盒，其中所述绝缘子序列是SEQ ID NO:28、29、30和/或38。6.如权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸表达盒，其中所述转基因编码在血友病或溶酶体贮积病中缺少或缺乏的蛋白质。7.如权利要求6所述的多核苷酸表达盒，其中所述转基因还编码一种或多种核酸酶。8.一种多核苷酸表达构建体，其包含肝特异性增强子序列、启动子序列、如SEQ ID NO:15、16或17中任一者所示的内含子序列以及转基因。9.如权利要求8所述的多核苷酸表达构建体，其中所述增强子序列包括野生型或突变的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白1增强子；和/或所述启动子序列包括野生型或突变的甲状腺素运载蛋白(TTR)启动子。10.如权利要求8或权利要求9所述的多核苷酸表达盒，其还包含含有绝缘子序列的至少一个间隔子序列和/或多腺苷酸化信号。11.如权利要求8至10中任一项所述的多核苷酸表达盒，其中所述转基因编码在血友病或溶酶体贮积病中缺少或缺乏的蛋白质。12.如权利要求8至11中任一项所述的多核苷酸表达盒，其中所述转基因还编码一种或多种核酸酶。13.一种多核苷酸表达构建体，其包含具有在SEQ ID NO:1
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13中任一者的位置1、5、14、32和/或39处的突变的肝特异性增强子序列、启动子序列和转基因。14.如权利要求13所述的多核苷酸表达构建体，其还包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：桑格摩生物治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：