用于核碱基编辑的锌指融合蛋白制造技术

本文提供了包含含有锌指蛋白和胞苷脱氨酶结构域的融合蛋白的碱基编辑器系统，以及使用该碱基编辑器系统的方法。该系统可用于特异性地改变靶DNA序列中的单个碱基对。性地改变靶DNA序列中的单个碱基对。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核碱基编辑的锌指融合蛋白
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求于2020年9月25日提交的美国临时专利申请63/083,662；2021年3月23日提交的美国临时专利申请63/164,893；以及2021年8月6日提交的美国临时专利申请63/230,580的优先权。那些优先权申请的公开通过整体引用并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，并且据此通过整体引用并入。在2021年9月22日创建的序列表的电子副本命名为025297_WO034_SL.txt，并且大小为529,443字节。

技术介绍

[0005]单碱基的精确DNA编辑在治疗和理解如遗传病的病症病症方面具有各种应用。例如，一个或多个基因的敲除可以通过使常规密码子转化为终止密码子，或者通过使剪接受体位点突变以引入外显子跳跃和/或移码突变来实现。此外，DNA点突变与广泛的病症相关联。单碱基编辑可用于纠正有害突变或者引入有益的遗传修饰。
[0006]胞苷脱氨酶将核碱基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(或者将核苷脱氧胞苷转化为胸苷)。这些酶在嘧啶补救途径中起作用，主要作用于单链DNA以使胞嘧啶转化成尿嘧啶，尿嘧啶随后在DNA复制或修复期间被胸腺嘧啶碱基替换。在细菌新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)中所鉴定的胞苷脱氨酶DddA可催化双链DNA内的胞嘧啶脱氨为尿嘧啶。DddA因此绕过了使dsDNA解旋为ssDNA的要求(Mok等人,Nature(2020)583:631
‑
7)。虽然Mok的研究报道了采用与转录激活因子样效应因子(TALE)蛋白融合的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器在人CCR5基因座处的C至T的碱基编辑，但尚不清楚该方法的适用范围有多广泛。另外，与DddA相比，对双链DNA起作用的新脱氨酶可以具有改善或改变的碱基编辑活性。
[0007]因此，仍然需要开发出用于预防和治疗多种疾病的精确碱基编辑系统。

技术实现思路

[0008]本公开提供了基于锌指蛋白(ZFP)的核碱基编辑系统及其用途。在一个方面，本公开提供了用于使细胞(例如，真核细胞或原核细胞，其中真核细胞可以是哺乳动物细胞，如人细胞、或植物细胞)的基因组中的胞嘧啶变为胸腺嘧啶的系统，该系统包括第一融合蛋白和第二融合蛋白、或者分别用于表达第一和第二融合蛋白的第一和第二表达构建体，其中a)第一融合蛋白包含：i)第一锌指蛋白(ZFP)结构域，该第一锌指蛋白结构域结合细胞中的靶基因组区中的第一序列，和ii)胞苷脱氨酶多肽的第一部分(例如，其中胞苷脱氨酶是包含与SEQ ID NO:49、81、92、95、98、101、104、107、134、143、152、157、162、167、172、177、184、189、194、199、204、209、214、或219至少90％相同的氨基酸序列的毒素衍生的脱氨酶(TDD))；b)第二融合蛋白包含：i)第二ZFP结构域，该第二ZFP结构域结合靶基因组区中的第二序列，和ii)胞苷脱氨酶多肽的第二部分；并且c)第一融合蛋白和第二融合蛋白与靶基因组区的结合导致了第一和第二部分的二聚化，其中二聚化部分形成了能够使靶基因组区中
的胞嘧啶变为尿嘧啶的活性胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，第一和第二部分自身缺乏胞苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，第一和第二部分形成了包含与SEQ ID NO:49、81、92、95、98、101、104、107、134、143、152、157、162、167、172、177、184、189、194、199、204、209、214、或219至少90％相同的氨基酸序列的活性胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，第一和第二部分形成了包含SEQ ID NO:49、81、92、95、98、101、104、107、134、143、152、157、162、167、172、177、184、189、194、199、204、209、214、或219的氨基酸序列的活性胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，靶基因组区可以特异于细胞中基因的特定等位基因。在一些实施方案中，靶向胞嘧啶可介于靶基因组区中的第一序列与第二序列的近端之间，任选地其中近端相距不超过100bp。
[0009]还提供了包含多于一对的第一和第二融合蛋白的本专利技术碱基编辑器系统的多重形式，其中每对融合蛋白结合不同的靶基因组区，任选地其中一对融合蛋白的第一和第二胞苷脱氨酶部分不同于另一对融合蛋白的第一和第二部分。
[0010]在一些实施方案中，碱基编辑器系统还包含在未编辑或编辑的链上产生单链DNA断裂的切口酶，其中DNA断裂与待编辑的胞嘧啶相距不超过约500bp，任选地不超过200bp，任选地约10
‑
50bp。切口酶可以是例如基于ZFP的切口酶、基于TALE的切口酶、或基于CRISPR的切口酶。在一些实施方案中，切口酶是通过第一切口酶结构域和第二切口酶结构域的二聚化形成的基于ZFP的切口酶，该第一切口酶结构域和第二切口酶结构域分别与两个结合靶基因组区的ZFP结构域融合，其中第一和第二切口酶结构域自身无活性，或者缺乏显著或特异性的切口酶活性。在某些实施方案中，切口酶结构域中的一者与第一或第二ZFP
‑
胞苷脱氨酶融合蛋白融合，并且另一个切口酶结构域与结合靶基因组区中的第三序列的第三ZFP结构域融合。替代性地，两个切口酶结构域可以分别地与结合靶基因组区中的第三序列的第三ZFP结构域以及结合靶基因组区中的第四序列的第四ZFP结构域融合。在特定实施方案中，第一和第二切口酶结构域衍生自FokI。
[0011]在一些实施方案中，碱基编辑器系统还包含胞苷脱氨酶的抑制组分，例如，毒素衍生的脱氨酶抑制剂(TDDI)，其中胞苷脱氨酶是TDD。例如，抑制剂可以是DddI组分，其中胞苷脱氨酶是DddA。在某些实施方案中，该系统包含第三融合蛋白或者用于在细胞中表达第三融合蛋白的第三表达构建体，其中第三融合蛋白包含i)ZFP结构域，该ZFP结构域结合靶基因组区中的第三序列，和ii)胞苷脱氨酶的抑制结构域(例如其中胞苷脱氨酶为TDD的TDDI，如其中胞苷脱氨酶为DddA的DddI)，并且第三融合蛋白与靶基因组区的结合导致了抑制结构域与二聚化胞苷脱氨酶部分相互作用，并由此对其胞苷脱氨酶活性进行抑制。
[0012]在含有抑制结构域的碱基编辑器系统的一些实施方案中，该系统包含第三融合蛋白或者用于在细胞中表达第三融合蛋白的第三表达构建体，以及第四融合蛋白或者用于在细胞中表达第四融合蛋白的第四表达构建体，其中第三融合蛋白包含i)ZFP结构域，该ZFP结构域结合靶基因组区中的第三序列，和ii)第一二聚化结构域；并且第四融合蛋白包含i)胞苷脱氨酶的抑制结构域(例如其中胞苷脱氨酶为TDD的TDDI，如其中胞苷脱氨酶为DddA的DddI)，和ii)能够在二聚化诱导剂存在下与第一二聚化结构域配偶的第二二聚化结构域；并且第三融合蛋白与靶基因组区的结合以及第三和第四融合蛋白的二聚化导致了抑制结构域与二聚化胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于使细胞基因组中的胞嘧啶变为胸腺嘧啶的系统，其包含第一融合蛋白和第二融合蛋白、或分别用于表达所述第一融合蛋白和第二融合蛋白的第一表达构建体和第二表达构建体，其中a)所述第一融合蛋白包含：i)第一锌指蛋白(ZFP)结构域，所述第一锌指蛋白结构域结合所述细胞中的靶基因组区中的第一序列，以及ii)胞苷脱氨酶多肽的第一部分，其中所述胞苷脱氨酶是包含与SEQ ID NO:49、81、92、95、98、101、104、107、134、143、152、157、162、167、172、177、184、189、194、199、204、209、214、或219至少90％相同的氨基酸序列的毒素衍生的脱氨酶(TDD)；b)所述第二融合蛋白包含：i)第二ZFP结构域，所述第二ZFP结构域结合所述靶基因组区中的第二序列，以及ii)所述胞苷脱氨酶多肽的第二部分；c)所述第一部分和第二部分自身缺乏胞苷脱氨酶活性；并且d)所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白与所述靶基因组区的结合导致所述第一部分和第二部分的二聚化，其中所述二聚化部分形成能够使所述靶基因组区中的胞嘧啶变为胸腺嘧啶的活性胞苷脱氨酶，任选地其中所述细胞是真核细胞，任选地其中所述真核细胞是哺乳动物细胞或植物细胞，进一步任选地，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。2.根据权利要求1所述的系统，其中所述靶基因组区特异于所述细胞中基因的特定等位基因。3.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述胞嘧啶介于所述靶基因组区中的所述第一序列与所述第二序列的邻近末端之间，任选地其中所述邻近末端相距不超过100bp。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的系统，其包含多于一对的所述第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中每对所述融合蛋白结合不同的靶基因组区。5.根据权利要求4所述的系统，其中一对融合蛋白的所述第一胞苷脱氨酶部分和第二胞苷脱氨酶部分不同于另一对融合蛋白的所述第一部分和第二部分。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的系统，其还包含在未编辑或编辑的链上产生单链DNA断裂的切口酶，其中所述DNA断裂与待编辑的胞嘧啶相距不超过约500bp，任选地不超过200bp，任选地约10
‑
50bp。7.根据权利要求6所述的系统，其中所述切口酶是基于ZFP的切口酶、基于TALE的切口酶、或基于CRISPR的切口酶。8.根据权利要求7所述的系统，其中所述切口酶是通过第一切口酶结构域和第二切口酶结构域的二聚化形成的基于ZFP的切口酶，所述第一切口酶结构域和所述第二切口酶结构域分别与两个结合所述靶基因组区的ZFP结构域融合，其中所述第一和第二切口酶结构域自身无活性。9.根据权利要求8所述的系统，其中使所述切口酶结构域中的一者与所述第一融合蛋白融合或所述第二融合蛋白融合，并且
使另一个切口酶结构域与结合所述靶基因组区中的第三序列的第三ZFP结构域融合。10.根据权利要求8所述的系统，其中所述两个切口酶结构域分别融合至i)第三ZFP结构域，所述第三ZFP结构域结合所述靶基因组区中的第三序列，以及ii)第四ZFP结构域，所述第四ZFP结构域结合所述靶基因组区中的第四序列。11.根据权利要求8
‑
10中任一项所述的系统，其中所述第一切口酶结构域和所述第二切口酶结构域衍生自FokI。12.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的系统，其还包含第三融合蛋白或者用于在所述细胞中表达所述第三融合蛋白的第三表达构建体，其中e)所述第三融合蛋白包含i)ZFP结构域，所述ZFP结构域结合所述靶基因组区中的第三序列，和ii)所述胞苷脱氨酶的抑制结构域；并且f)所述第三融合蛋白与所述靶基因组区的结合导致所述抑制结构域与所述二聚化胞苷脱氨酶部分结合，并由此抑制所述二聚化胞苷脱氨酶部分的胞苷脱氨酶活性。13.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的系统，其还包含第三融合蛋白或者用于在所述细胞中表达所述第三融合蛋白的第三表达构建体，以及第四融合蛋白或者用于在所述细胞中表达所述第四融合蛋白的第四表达构建体，其中E)所述第三融合蛋白包含i)ZFP结构域，所述ZFP结构域结合所述靶基因组区中的第三序列，和ii)第一二聚化结构域；并且f)所述第四融合蛋白包含i)所述胞苷脱氨酶的抑制结构域，以及ii)第二二聚化结构域，所述第二二聚化结构域能够在二聚化诱导剂存在下与所述第一二聚化结构域配偶；并且g)所述第三融合蛋白与所述靶基因组区的结合以及所述第一二聚化结构域和所述第二二聚化结构域的二聚化导致了所述抑制结构域与所述二聚化胞苷脱氨酶部分结合，并由此抑制所述二聚化胞苷脱氨酶部分的胞苷脱氨酶活性。14.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的系统，其还包含第三融合蛋白或者用于在所述细胞中表达所述第三融合蛋白的第三表达构建体，以及第四融合蛋白或者用于在所述细胞中表达所述第四融合蛋白的第四表达构建体，其中E)所述第三融合蛋白包含i)ZFP结构域，所述ZFP结构域结合所述靶基因组区中的第三序列，和ii)第一二聚化结构域；并且f)所述第四融合蛋白包含i)所述胞苷脱氨酶的抑制结构域，以及ii)第二二聚化结构域，所述第二二聚化结构域能够在不存在二聚化抑制剂的情况下与所述第一二聚化结构域配偶；并且g)所述第三融合蛋白与所述靶基因组区的结合以及所述第一二聚化结构域和所述第二二聚化结构域的二聚化导致了所述抑制结构域与所述二聚化胞苷脱氨酶部分结合，并由此抑制所述二聚化胞苷脱氨酶部分的胞苷脱氨酶活性。
15.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述ZFP结构域独立地具有2、3、4、5、6、7、或8个锌指。16.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述表达构建体位于相同或单独的病毒载体上。17.根据权利要求16所述的系统，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、或慢病毒载体。18.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的系统，其中所述TDD包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。19.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的系统，其中所述TDD包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的TDD的毒性结构域。20.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的系统，其中所述胞苷脱氨酶是包含与SEQ ID NO:49或81的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的TDD。21.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的系统，其中所述TDD包含SEQ ID NO:49或81的氨基酸序列。22.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的系统，其中所述第一胞苷脱氨酶部分和所述第二胞苷脱氨酶部分包含SEQ IDNO:72的以下项：分别地氨基酸1264
‑
1333和1334
‑
1427；分别地氨基酸1264
‑
1397和1398
‑
1427；分别地氨基酸1264
‑
1404和1405
‑
1427；分别地氨基酸1264
‑
1407和1408
‑
1427；分别地氨基酸1290
‑
1333和1334
‑
1427；分别地氨基酸1290
‑
1397和1398
‑
1427；分别地氨基酸1290
‑
1404和1405
‑
1427；或分别地氨基酸1290
‑
1407和1408
‑
1427；或反之亦然。23.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的系统，其中：所述第一胞苷脱氨酶部分和所述第二胞苷脱氨酶部分分别地包含SEQ ID NO:82和83，SEQ ID NO:84和85，SEQ ID NO:18和19，SEQ ID NO:51和52，或SEQ ID NO:53和54；或反之亦然。24.根据权利要求18
‑
23中任一项所述的系统，其中所述TDD在选自Y1307、T1311、S1331、V1346、H1366、N1367、N1368、P1369、E1370、G1371、T1372、F1375、V1392、P1394、P1395、I1399、P1400、V1401、K1402、A1405和T1406的一个或多个残基处具有突变，其中所述残基相对于SEQID NO:72进行编号。25.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的系统，其中所述胞苷脱氨酶是包含SEQ ID NO:86
‑
91和117
‑
129中任一者的氨基酸序列的TDD。
26.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的系统，其中所述胞苷脱氨酶包含含有SEQ ID NO:86
‑
91和117
‑
129中任一者的氨基酸序列的TDD的毒性结构域。27.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的系统，其中所述TDD包含与SEQ ID NO:92、95、98、101、104、...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：桑格摩生物治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：