酰胺酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种酰胺酶突变体及其应用，包括：(a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)在(a)中所示氨基酸序列的如下至少一个位点：L81、E62、M311、N180、P121、R58、E32、T230、N82、N190、D192、D217、H219、K77、M78、P79、F80、F61、D185、D59、L182、T183、P184、I227、C228、G229、A231或V232，经过氨基酸突变且具有酰胺酶功能的蛋白质；或(c)与(a)和(b)中任一项限定的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有酰胺酶功能的蛋白质。能够解决现有技术中酰胺酶立体选择性和催化活性不高的问题，适用于酶催化领域。酶催化领域。酶催化领域。

【技术实现步骤摘要】
酰胺酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种酰胺酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]手性羧酸和酰胺衍生物是合成大量手性生物活性分子的关键中间体，在精细化工、医药、农用化学品及功能材料等方面有着广泛的应用。化学法合成手性羧酸和酰胺衍生物存在产品总收率低、选择性差、合成工艺成本高等限制，不适合工业化规模的生产。
[0003]酰胺酶(amidase，EC 3.5.1.X)是一类催化酰胺化合物水解生成羧酸和氨的重要水解酶。酰胺酶的底物谱广泛，涵盖了脂肪族、芳香族、杂环类化合物等；酰胺酶一般还具有良好的立体选择性，其中以S
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型酰胺酶居多，但R
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型酰胺酶近些年也在不断被发掘。酰胺酶的这些特点使其在动力学拆分外消旋酰胺制备手性羧酸、手性酰胺衍生物方面具有无可比拟的优势，越来越受到研究者的重视。一系列以酰胺酶为催化剂合成手性羧酸和/或酰胺衍生物的生物合成新工艺被开发，其中包括S
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2，2
‑
二甲基环丙甲酰胺、1
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氰基环己基乙酸、R
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3，3，3
‑
三氟
‑2‑
羟基
‑2‑
甲基丙酸、2
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氯烟酸等重要医药中间体。
[0004]野生型酰胺酶(自然界中获得)有一定的局限性，其在催化活性、立体选择性和稳定性等方面的不足限制了它在工业生产中的应用。不过，随着蛋白质工程的不断发展以及对酰胺酶结构功能的更深入了解，酶进化技术的应用使得改变酶的催化特性成为可能。专利CN107937376B公开了一种泛生菌来源的酰胺酶用于合成2
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氯烟酸，通过酶进化使其活性提高了2
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3倍，对底物
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氯烟酰胺的耐受性超过200mM。另外，Tang,X.L.,et al对来自于Pantoea sp.的酰胺酶进行定向进化，使酰胺酶的催化活力都得到了提高，单突变体G175A和双突变体G175A/A305T的活力分别提高了3.2倍和3.7倍，Kcat/Km值提高到野生型的3.1倍和10.0倍(Appl Environ Microbio 2019 85(5):e02471
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18)。因此，通过对野生型酰胺酶进行酶进化，改变其催化性能，促进酶催化越来越适应相应的工业化生产的需要是十分必要的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种酰胺酶突变体及其应用，以解决现有技术中野生型酰胺酶立体选择性和催化活性不高的问题。
[0006]为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种酰胺酶突变体，包括：(a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)在(a)中所示氨基酸序列的如下至少一个位点：L81、E62、M311、N180、P121、R58、E32、T230、N82、N190、D192、D217、H219、K77、M78、P79、F80、F61、D185、D59、L182、T183、P184、I227、C228、G229、A231或V232，经过氨基酸突变且具有酰胺酶功能的蛋白质；或(c)与(a)和(b)中任一项限定的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有酰胺酶功能的蛋白质。
[0007]进一步地，上述(b)的氨基酸突变各自独立地选自如下：L81A或L81C或L81V；P79Q；F80G；E62Q或E62K或E62M或E62T或E62A或E62R或E62C或E62V或E62P或E62H或E62N或E62S；
L76V；K77T；D185H；R58M或R58K或R58L或R58H或R58A；I227L或I227V或I227A或I227W或I227E或I227S或I227M或I227D或I227C或I227Y；T230C或T230V或T230A或T230L；N180V或N180D或N180K；P121H或P121K或P121N或P121A或P121R或P121E或P121Y或P121S；M311C或M311R或M311H或M311S；V232I；R58L或R58M或R58K或R58Q或R58P或R58A或R58V或R58F；E32D或E32H或E32M或E32Q或E32A或E32C或E32V或E32F或E32I或E32P或E32T；其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸；优选地，(c)中，与(a)或(b)中限定的氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且具有酰胺酶功能的蛋白质。
[0008]进一步地，上述酰胺酶突变体的突变包括如下任意一种氨基酸突变：L81A；L81C；L81V；P79Q；F80G；E62Q；E62K；E62M；E62T；L76V；K77T；D185H；R58M；I227L；I227V；T230C；L81A+E62T；L81A+E62K；L81A+E62M；L81A+I227V；L81A+T230C；L81A+A231R；L81A+L76V；L81A+I227V；L81A+N180V；L81A+N180D；L81A+N180K；L81A+P121H；L81A+P121K；L81A+P121N；L81A+P121A；L81A+M311C；L81A+M311R；L81A+M311H；L81A+M311S；L81A+E62T+P121A；L81A+E62T+P121H；L81A+E62T+P121N；L81A+E62T+P121R；L81A+E62T+I227A；L81A+E62T+M311C；L81A+E62T+M311R；L81A+E62T+M311H；L81A+E62T+M311S；L81A+E62T+T230C；L81A+E62T+T230V；L81A+E62T+V232I；L81A+E62T+R58L；L81A+E62T+R58M；L81A+E62T+R58K；L81A+E62T+R58Q；L81A+E62T+E32D；L81A+E62T+E32H；L81A+E62T+E32M；L81A+E62T+M311C+E32Q；L81A+E62T+M311C+E32M；L81A+E62T+M311C+E32D；L81A+E62T+M311C+E32A；L81A+E62T+M311C+E32C；L81A+E62T+M311C+E32V；L81A+E62T+M311C+P121E；L81A+E62T+M311C+P121A；L81A+E62T+M311C+P121H；L81A+E62T+M311C+P121R；L81A+E62T+M311C+P121N；L81A+E62R+M311C；L81A+E62A+M311C；L81A+E62C+M311C；L81A+E62V+M311C；L81A+E62P+M311C；L81A+E62M+M311C；L81A+E62T+M311C+R58K；L81A+E62T+M311C+R58L；L81A+E62T+M311C+R58H本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酰胺酶突变体，其特征在于，包括：(a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)在(a)中所示氨基酸序列的如下至少一个位点：L81、E62、M311、N180、P121、R58、E32、T230、N82、N190、D192、D217、H219、K77、M78、P79、F80、F61、D185、D59、L182、T183、P184、I227、C228、G229、A231或V232，经过氨基酸突变且具有酰胺酶功能的蛋白质；或(c)与(a)和(b)中任一项限定的所述氨基酸序列具有80％以上同源性且具有酰胺酶功能的蛋白质。2.根据权利要求1所述的酰胺酶突变体，其特征在于，所述(b)的所述氨基酸突变各自独立地选自如下：L81A或L81C或L81V；P79Q；F80G；E62Q或E62K或E62M或E62T或E62A或E62R或E62C或E62V或E62P或E62H或E62N或E62S；L76V；K77T；D185H；R58M或R58K或R58L或R58H或R58A；I227L或I227V或I227A或I227W或I227E或I227S或I227M或I227D或I227C或I227Y；T230C或T230V或T230A或T230L；N180V或N180D或N180K；P121H或P121K或P121N或P121A或P121R或P121E或P121Y或P121S；M311C或M311R或M311H或M311S；V232I；R58L或R58M或R58K或R58Q或R58P或R58A或R58V或R58F；E32D或E32H或E32M或E32Q或E32A或E32C或E32V或E32F或E32I或E32P或E32T；其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸；优选地，所述(c)中，与(a)或(b)中限定的所述氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且具有酰胺酶功能的蛋白质。3.根据权利要求2所述的酰胺酶突变体，其特征在于，所述酰胺酶突变体的突变包括如下任意一种氨基酸突变：L81A；L81C；L81V；P79Q；F80G；E62Q；E62K；E62M；
E62T；L76V；K77T；D185H；R58M；I227L；I227V；T230C；L81A+E62T；L81A+E62K；L81A+E62M；L81A+I227V；L81A+T230C；L81A+A231R；L81A+L76V；L81A+I227V；L81A+N180V；L81A+N180D；L81A+N180K；L81A+P121H；L81A+P121K；L81A+P121N；L81A+P121A；L81A+M311C；L81A+M311R；L81A+M311H；L81A+M311S；L81A+E62T+P121A；L81A+E62T+P121H；L81A+E62T+P121N；L81A+E62T+P121R；L81A+E62T+I227A；L81A+E62T+M311C；L81A+E62T+M311R；L81A+E62T+M311H；L81A+E62T+M311S；L81A+E62T+T230C；L81A+E62T+T230V；L81A+E62T+V232I；L81A+E62T+R58L；L81A+E62T+R58M；L81A+E62T+R58K；L81A+E62T+R58Q；L81A+E62T+E32D；L81A+E62T+E32H；L81A+E62T+E32M；L81A+E62T+M311C+E32Q；L81A+E62T+M311C+E32M；L81A+E62T+M311C+E32D；L81A+E62T+M311C+E32A；L81A+E62T+M311C+E32C；L81A+E62T+M311C+E32V；L81A+E62T+M311C+P121E；
L81A+E62T+M311C+P121A；L81A+E62T+M311C+P121H；L81A+E62T+M311C+P121R；L81A+E62T+M311C+P121N；L81A+E62R+M311C；L81A+E62A+M311C；L81A+E62C+M311C；L81A+E62V+M311C；L81A+E62P+M311C；L81A+E62M+M311C；L81A+E62T+M3...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英生命科学技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：