一种腈水解酶及其在2-羟基-4-甲硫基丁酸合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种腈水解酶及其在2

【技术实现步骤摘要】
一种腈水解酶及其在2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁酸合成中的应用


[0001]本专利技术属于生物催化
，涉及一种来源于变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)的腈水解酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和细胞，以及它们的制备方法及其在制备2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁酸中的应用。

技术介绍

[0002]2‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁酸(HMTBA)是蛋氨酸羟基类似物。在动物体内，HMTBA可转化为蛋氨酸，与等量蛋氨酸具有相同的生物效价。此外，蛋氨酸羟基类似物还表现出一些特有性质，如良好的抑菌效果，增强动物机体免疫力及抗氧化能力，有效减缓应激反应的损害等。因此，HMTBA作为一种性能优越的蛋氨酸源广泛用于家禽和猪的饲料添加剂。
[0003]蛋氨酸羟基类似物目前主要采用氰醇水解法制备，2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁腈(HMBTN)在硫酸催化下水合为2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁酰胺(HMTBAm)，用水稀释后，升温完全水解为HMTBA，然后用有机溶剂萃取。该方法需要使用强酸，反应在较高温度下进行，设备腐蚀严重，而且产生有毒的氢氰酸和大量的硫酸铵或硫酸氢氨，环境污染严重，产品分离困难。
[0004]利用生物催化法来进行腈的转化，其优势不仅在于反应条件温和、环境污染少，副产物少，还符合原子经济性、绿色环保和可持续发展的要求。
[0005]曹达公司和罗纳
‑
普朗克公司等都对腈水解酶催化的2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁腈水解制备2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁酸工艺进行了研究，其反应如式(I)所示。李宗通等筛选到一株产腈水解酶的菌株，并利用该菌株的整细胞将HMTBN转化为HMTBA，底物浓度为150mM，细胞只能使用一次。综上，现有腈类物质的生物催化法转化仍然存在酶对底物的耐受性差，转化强度不高等问题。
[0006][0007]综上所述，在现有的腈水解酶参与的生物催化法制备蛋氨酸羟基类似物技术路线中，仍然存在关键酶腈水解酶水解反应对底物的耐受性差，转化强度不高等问题，限制了其在工业规模的应用。因此，通过基因组数据挖掘等方法开发底物耐受性强的高效腈水解酶，绿色高效地制备蛋氨酸羟基类似物具有重要的工业应用价值。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种腈水解酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和细胞，以及它们的制备方法以及利用其作为催化剂，绿色高效水解制备蛋氨酸羟基类似物的应用，从而解决现有的腈水解酶催化合成蛋氨酸羟基类似物的技术存在的酶对底物的耐受性差，转化强度不高的问题。
[0009]本专利技术的专利技术人从德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的菌株保藏编号为DSM 16265
的变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)中获得可以催化2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁腈水解制备2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁酸的腈水解酶KvNLE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；通过进一步对腈水解酶KvNLE进行分子手段的改造，得到一种将其第168位脯氨酸替换为甲硫氨酸的突变体KvNLE
‑
P168M，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；与KvNLE相比，KvNLE
‑
P168M的2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁酸的生产效率显著提高，达7.4kg/kg
DCW
/h。
[0010]在第一方面，本专利技术提供一种腈水解酶KvNLE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其可以催化2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁腈水解制备2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁酸。
[0011]本专利技术提供的上述腈水解酶KvNLE可以是天然、重组或合成的活性多肽，具体地，该活性多肽可以是天然纯化的产物、化学合成的产物，或是使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中产生的产物。
[0012]在一些实施方案中，上述腈水解酶是通过将含有其编码基因的重组载体转化导入大肠杆菌表达宿主(例如E.coli BL21(DE3))构建的重组基因工程菌株，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到腈水解酶。
[0013]在第二方面，本专利技术提供一种编码上述腈水解酶的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
[0014]本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过使用PCR仪扩增或人工合成的方法获得。
[0015]在第三方面，本专利技术提供上述腈水解酶的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，第168位脯氨酸突变为甲硫氨酸，其在2
‑
羟基
‑4‑
甲硫基丁酸的生产效率方面与上述腈水解酶相比有显著提高。
[0016]本专利技术提供的上述突变体可人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到，如使用重组技术从原核生物(大肠杆菌)中表达获得。
[0017]在一些实施方案中，上述突变体是通过将含有其编码基因的重组载体转化进入大肠杆菌表达宿主(例如E.coli BL21(DE3))构建重组基因工程菌，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到突变体。
[0018]在第四方面，本专利技术提供一种编码上述突变体的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0019]本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过使用PCR仪扩增或人工合成的方法获得。
[0020]第五方面，本专利技术提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。
[0021]在一些实施方案中，上述重组载体为pET26b(+)
‑
KvNLE或pET26b(+)
‑
KvNLE
‑
P168M，分别是将编码上述腈水解酶的核酸分子或上述突变体的核酸分子替换pET
‑
26b(+)的BamHI和EcoRI酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
[0022]在第六方面，本专利技术提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的重组载体。
[0023]在一些实施方案中，所述重组细胞经诱导后表达上述腈水解酶或突变体。
[0024]在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括如下：
[0025]将所述重组载体转化到表达宿主细胞中，经培养并添加诱导剂诱导表达，得到上述腈水解酶或突变体。
[0026]进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腈水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.编码权利要求1所述的腈水解酶的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.权利要求1所述的腈水解酶的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。4.编码权利要求3所述的突变体的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。5.一种重组载体，其包含权利要求2或4所述的核酸分子。6.一种重组细胞，其包含权利要求5所述的重组载体。7.一种腈水解酶或其突变体的制备方法，其包括以下步骤：1)对权利要求6所述的重组细胞进行培养，并诱导腈水解酶或其突变体表达；2)从1)得到的培养物中分离权利要求1所述的腈水解酶或权利要求3所述突变体。8.权利要求1所述的腈水解酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的突变体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组细胞和/或权利要求7所述的方法制备得到的腈水解酶或其突变体在制备2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张光祥，王竞辉，姜君鹏，黎源，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：