一种精氨酸脱亚胺酶突变体、其重组体及其在催化生产瓜氨酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种精氨酸脱亚胺酶突变体、其重组体及其催化生产瓜氨酸中的应用，通过精氨酸脱亚胺酶突变体与辅助侵染蛋白残基突变体的融合表达，构建出外泌的固定化酶，与原始酶相比，催化温度显著提升，该酶可在合适的pH和温度下与其生产细胞结合，完成一步纯化

【技术实现步骤摘要】
一种精氨酸脱亚胺酶突变体、其重组体及其在催化生产瓜氨酸中的应用


[0001]本专利技术涉及一种生物酶固定化
，特别涉及一种精氨酸脱亚胺酶突变体、其重组体及其在催化生产瓜氨酸中的应用。

技术介绍

[0002]催化剂的发现为工业化生产加速，生物酶作为一种天然高分子催化剂，具有催化效率高、特异性强，反应条件温和、无有机试剂污染的特点。然而，由于游离生物酶的物理化学性质不稳定，导致在实际应用过程中生物酶无法长期保持催化活性，也就无法发挥其最大的催化性能。生物酶固定化技术的出现不仅实现了酶的重复利用，而且可以改善酶的催化性能及活性。
[0003]瓜氨酸(Citrulline)又名氨基甲酰鸟氨酸(Carbamylornithineornithin)，是一种非蛋白质α
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氨基酸，涉及了一系列的代谢过程，如尿素循环，精氨酸
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瓜氨酸循环等；具有清除自由基、维持正常胆固醇水平、影响人体内氮平衡、心血管系统的免疫调节、帮助脑细胞储存和恢复信息等生理功能。由于瓜氨酸的抗衰老、增强免疫力、提高运动员肌肉力量和耐力等功能，已有加拿大公司生产的运动功能性饮料中添加瓜氨酸。
[0004]国际上关于瓜氨酸的生产方法主要有三种：发酵法、化学合成法和酶法。化学合成法生产控制难度大且造成较多生产废水。发酵法目前的生产成本较高。而相对前两种方法，酶法拥有更多的优良性质，在生产过程中无需添加其他物质或进行其他反应，工艺步骤简单，容易操作，生产周期短。
[0005]精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase，ADI，EC 3.5.3.6)可催化精氨酸生产瓜氨酸的水解酶，具有酶法合成瓜氨酸的应用前景。专利CN201510412709、CN201510230669、CN201510101489、CN201510712520等就采用了如上的酶法工艺，但底物浓度偏低，且菌株培养周期相对长，在产业化推进上多有不利。基因编码区随机的突变可使酶的结构改变，从而提高热力学稳定性或者动力学稳定性，从而提高酶的催化活性。专利CN201510012021、CN201710119423获得了活性提高的突变体，但其整体工艺在产业化上具有局限性。如今，多种固定化酶手段被开发出来，最早的是借助载体与酶之间的相互作用力或形成共价键来固定化酶，后期随着技术的发展，包埋法的固定化技术被广泛用于酶的固定化。专利CN200610145655、CN111394295A建立了酶的固定化工艺，但相关工艺步骤繁琐或具有不确定性，虽然拥有较高的转化率，但底物浓度不是很高。
[0006]总之，本领域亟需一种能够降低生产成本、提高经济效益、实现酶的重复利用，还能解决酶回收难、成本高等问题的新技术。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中的不足之处，本专利技术通过精氨酸脱亚胺酶突变基因与辅助侵染蛋白残基突变体的基因的融合表达，构建出外泌的融合酶，该酶的最适温度较原始提高10℃，
可在合适的pH和温度下与其生产细胞结合，完成一步纯化
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固定化过程，形成稳定性提高的酶以及连续催化生产，实现了其在催化生产瓜氨酸中的应用，为酶法工业化生产提供有效途径。该突变体耐受的pH域广，与活性酶进行融合表达，融合表达后的酶同时具有催化活性域与固定化能力。
[0008]本专利技术第一方面提供了一种精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术另一方面提供了一种精氨酸脱亚胺酶重组质粒，所述重组质粒为将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与精氨酸脱亚胺酶突变体的基因重组；其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述精氨酸脱亚胺酶突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术第二方面提供了一种含所述重组质粒的外泌精氨酸脱亚胺酶重组菌体；所述精氨酸脱亚胺酶重组菌体是通过将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与精氨酸脱亚胺酶突变体的基因进行融合表达而得，其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]进一步地，所述重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸菌等革兰氏阳性菌。
[0012]进一步地，所述突变体精氨酸脱亚胺酶蛋白能够在重组菌体发酵过程中外泌表达，分布于发酵液中，大量生产后不会影响细胞营养的摄入和代谢空间；且融合表达后的菌体相对于原始菌株具有更宽的pH稳定条件(pH 5.0
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6.0)。
[0013]本专利技术第三方面提供了一种上文所述的外泌精氨酸脱亚胺酶重组菌体在催化生产瓜氨酸中的应用；包括利用所述精氨酸脱亚胺酶重组菌体发酵获得的精氨酸脱亚胺酶在其生产菌株上的自固定化过程。
[0014]进一步地，所述发酵过程中的底物溶液为浓度50
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650g/L、pH为5.0
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6.0的L
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精氨酸溶液或者L
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精氨酸盐酸盐溶液。
[0015]进一步地，所述发酵过程中的底物溶液浓度为600
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650g/L。
[0016]进一步地，所述应用还包括精氨酸脱亚胺固定化酶循环工艺：所述重组菌体发酵所得的精氨酸脱亚胺酶在其生产菌株上自固定化得精氨酸脱亚胺酶固定化载体后，进行发酵培养，发酵过程中的精氨酸脱亚胺酶固定化载体的浓度为30
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80g/50L，发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件(25
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30℃，pH 7.5)下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于22次，每次发酵时间不超过6h。这是一种纯化
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固定化的连续催化工艺，其适用范围广，具有良好的工业应用价值。
[0017]进一步地，所述应用的发酵条件为35～55℃、pH 5.0～7.0；更优选40
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50℃、pH 5.0
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6.0。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]1.一种辅助侵染蛋白IAP残基突变体与突变的精氨酸脱亚胺酶蛋白融合表达的设计方案，能够同时实现催化过程和外泌酶的纯化固定化；
[0020]2.与表面展示不同，培养过程中外泌精氨酸脱亚胺酶外泌表达，分布于发酵液中，大量生产后不会影响细胞营养的摄入和代谢空间；
[0021]3.所述固定化酶的催化工艺可放大和循环，其能够在22次的循环次数下仍保持催化活性；产物浓度不降低。
[0022]4.固定化酶能够高效催化高浓度精氨酸(600g/L)生成瓜氨酸。
[0023]5.通过本申请的对比例和实施例数据对比分析可知：所获得的外泌蛋白能够在特定的环境下(在pH7.5附近结合、室温)固定化到无/有活性的基质上，所述基质来本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种精氨酸脱亚胺酶重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与精氨酸脱亚胺酶突变体的基因重组；其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述精氨酸脱亚胺酶突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种含权利要求1所述重组质粒的外泌精氨酸脱亚胺酶重组菌体；其特征在于，所述精氨酸脱亚胺酶重组菌体是通过将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与精氨酸脱亚胺酶突变体的基因进行融合表达而得，其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求3所述的重组菌体，其特征在于，所述重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸菌中的一种。5.如权利要求3所述的外泌精氨酸脱亚胺酶重组菌体在催化生产瓜氨酸中的应用；其特征在于，包括利用所述精氨酸脱亚胺酶重组菌体发酵获得的精氨酸脱亚胺酶在其生产菌株上的自固定化过程。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵过程中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：范超，齐佳琨，洪皓，刘军，刘明，吴文忠，
申请(专利权)人：大连医诺生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：