【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和生物化工，涉及一种生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、l-蛋氨酸是人体和动物所必需的唯一含硫氨基酸，是人体和动物体不能自身合成的八种必需氨基酸之一，必须通过食物获取。l-蛋氨酸具有非常重要的生理功能，在食品、医药、饲料等行业应用广泛。近年来，l-蛋氨酸的市场需求量快速增加，其产业步入黄金期，同时对生产技术和成本等方面带来挑战。
2、目前l-蛋氨酸主要生产方法为化学法，通过丙烯醛为原料合成蛋氨酸，在合成过程中需要使用氢氰酸等高挥发性有毒物质，而合成产物是消旋的dl-蛋氨酸，需要进一步用氨基酰化酶进行手性拆分。随着合成生物学的快速发展，构建微生物细胞工厂成为蛋氨酸绿色高效生产的重要手段。谷氨酸、赖氨酸等工业氨基酸的大规模发酵生产已经成熟，为l-蛋氨酸的工业化发酵生产提供了可能。微生物发酵法除直接生产l-蛋氨酸外，还避免了使用对环境不利的有机化合物。但是以葡萄糖为原料，从头合成l-蛋氨酸的生产强度和糖酸转化率都还处于较低水平，无法满足工业化需求。
3、近年来，发酵-酶法路线的出现为l-蛋氨酸的生产提供了一种新的选择。l-蛋氨酸的发酵-酶法路线是以葡萄糖为底物，首先发酵生产l-蛋氨酸前体o-琥珀酰-l-高丝氨酸，再通过酶催化反应将l-蛋氨酸前体o-琥珀酰-l-高丝氨酸转化为l-蛋氨酸。为了通过发酵-酶法路线高效生产l-蛋氨酸，开发能够以高产率和高效率生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的菌株，确保o-琥珀酰-l-高丝氨酸的高效发酵制备，对于大规模生产l-蛋
4、综上所述，开发能够高效生产l-蛋氨酸前体o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌，对于l-蛋氨酸生产领域具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌及其构建方法和应用，本专利技术设计独特改造策略，成功构建生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌，并进行进一步改造，显著提高o-琥珀酰-l-高丝氨酸的产量，实现高效、低成本生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸。
2、为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌，所述工程大肠杆菌中包括如下基因被敲除或弱化表达量：
4、(1)负调控阻遏因子基因、o-琥珀酰-l-高丝氨酸裂解酶基因和同型丝氨酸激酶基因(thrb)，以及，
5、(2)胱硫醚-β-裂解酶基因、蛋氨酸合成酶基因或高半胱氨酸甲基转移酶基因中任意一种或至少两种的组合。
6、本专利技术中，对大肠杆菌进行改造，敲除或弱化大肠杆菌中蛋氨酸合成途径中的负调控阻遏因子基因(metj)、o-琥珀酰-l-高丝氨酸裂解酶基因(metb)以及同型丝氨酸激酶基因(thrb)，同时敲除或弱化胱硫醚-β-裂解酶基因(metc)、蛋氨酸合成酶基因(meth)或高半胱氨酸甲基转移酶基因(mete)中的至少一个，使得改造后大肠杆菌能够生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸，为开发生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸菌株提供新思路。
7、可以理解，本专利技术中敲除或弱化大肠杆菌中蛋氨酸合成途径中的负调控阻遏因子基因(metj)、o-琥珀酰-l-高丝氨酸裂解酶基因(metb)以及同型丝氨酸激酶基因(thrb)，以及同时敲除同时敲除或弱化胱硫醚-β-裂解酶基因(metc)、蛋氨酸合成酶基因(meth)或高半胱氨酸甲基转移酶基因(mete)中的至少一个均能实现构建生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸菌株，例如本专利技术一具体实施方式中敲除metj、metb、thrb以及metc。
8、优选地，所述工程大肠杆菌中如下基因被敲除或弱化表达量：负调控阻遏因子基因metj、o-琥珀酰-l-高丝氨酸裂解酶基因metb以及同型丝氨酸激酶基因thrb，同时敲除胱硫醚-β-裂解酶基因metc、蛋氨酸合成酶基因meth、高半胱氨酸甲基转移酶基因mete。
9、优选地，所述工程大肠杆菌中还过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、天冬氨酸转氨酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶ⅰ基因和高丝氨酸琥珀酰转移酶基因。
10、本专利技术中，进一步在构建的生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌中过表达合成l-蛋氨酸前体o-琥珀酰-l-高丝氨酸的相关基因，包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)、天冬氨酸转氨酶基因(aspc)、天冬氨酸激酶基因(lysc)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、高丝氨酸脱氢酶ⅰ基因(thra)、高丝氨酸琥珀酰转移酶基因(meta)，能够进一步提高o-琥珀酰-l-高丝氨酸的产量。
11、可以理解，本领域常用大肠杆菌均适合作为本专利技术的工程大肠杆菌的底盘菌株，可根据需求进行选择，不作特殊限制，例如，所述底盘菌株可包括escherichia coli k12mg1655、escherichia coli bl21、escherichia coli bl21(de3)或escherichia colibl21(de3)plyss中任意一种或至少两种的组合，优选为escherichia coli k12 mg1655。
12、第二方面，本专利技术提供一种第一方面所述的生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌的构建方法，所述构建方法包括：
13、敲除或弱化底盘大肠杆菌中包括如下基因：(1)负调控阻遏因子基因、o-琥珀酰-l-高丝氨酸裂解酶基因和同型丝氨酸激酶基因(thrb)，以及，(2)胱硫醚-β-裂解酶基因、蛋氨酸合成酶基因、高半胱氨酸甲基转移酶基因中任意一种或至少两种的组合，得到所述生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌。
14、优选地，所述构建方法还包括在底盘大肠杆菌中过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、天冬氨酸转氨酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶ⅰ基因和高丝氨酸琥珀酰转移酶基因的步骤。
15、可以理解，本专利技术中所述过表达指提高基因的表达量，本领域中通用提高基因表达量的方法均适用于本专利技术。
16、优选地，所述过表达的方法可包括：
17、利用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、天冬氨酸转氨酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶ⅰ基因和高本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的工程大肠杆菌，其特征在于，所述工程大肠杆菌中包括如下基因被敲除或弱化表达量：
2.根据权利要求1所述的生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的工程大肠杆菌，其特征在于，所述工程大肠杆菌中还过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、天冬氨酸转氨酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶Ⅰ基因和高丝氨酸琥珀酰转移酶基因。
3.一种如权利要求1或2所述的生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
4.根据权利要求3所述的生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括在底盘大肠杆菌中过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、天冬氨酸转氨酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶Ⅰ基因和高丝氨酸琥珀酰转移酶基因的步骤。
5.根据权利要求4所述的生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述过表达的方法包括：
6.根据权利要求5所述的生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的工程大肠杆菌的构
7.根据权利要求3-6任一项所述的生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的工程大肠杆菌的构建方法，其特在于，所述底盘大肠杆菌包括Escherichia coli K12 MG1655、Escherichiacoli BL21、Escherichia coli BL21(DE3)或Escherichia coli BL21(DE3)pLysS中任意一种或至少两种的组合。
8.权利要求1或2所述的生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的工程大肠杆菌在生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸中的应用。
9.一种生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
10.根据权利要求9所述的生产O-琥珀酰-L-高丝氨酸的方法，其特征在于，所述培养的培养基含有甲硫氨酸、葡萄糖、氯化铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、氯霉素、卡娜霉素和氨苄青霉素；
...【技术特征摘要】
1.一种生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌，其特征在于，所述工程大肠杆菌中包括如下基因被敲除或弱化表达量：
2.根据权利要求1所述的生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌，其特征在于，所述工程大肠杆菌中还过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、天冬氨酸转氨酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶ⅰ基因和高丝氨酸琥珀酰转移酶基因。
3.一种如权利要求1或2所述的生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
4.根据权利要求3所述的生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括在底盘大肠杆菌中过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、天冬氨酸转氨酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶ⅰ基因和高丝氨酸琥珀酰转移酶基因的步骤。
5.根据权利要求4所述的生产o-琥珀酰-l-高丝氨酸的工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述过表达的方法包括：
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【专利技术属性】
技术研发人员：常红星，王竞辉，杨付伟，马光，赵伟，夏顺炜，杨栋琳，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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