一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其变体和应用制造技术

本发明专利技术属于微生物技术和酶工程技术领域，提供一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其变体和应用。本发明专利技术从牛奶中分离出一株金黄色葡萄球菌噬菌体DZ25，并克隆、表达出裂解酶基因，命名为LysDZ25，进而研究其性质并进行理性设计，获得一系列金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体，并通过实验验证筛选获得在高温条件下同样具有显著金黄色葡萄球菌裂解性能的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体，非常有助于实际生产生活应用，为开发控制金黄色葡萄球菌的新型有效的生物绿色抑制剂奠定了基础，因此具有良好的实际应用之价值。的实际应用之价值。的实际应用之价值。

【技术实现步骤摘要】
一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其变体和应用


[0001]本专利技术属于微生物技术和酶工程
，具体涉及一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其变体和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]金黄色葡萄球菌是一种常见的致病微生物和重要的医院内感染细菌，是引起血液、下呼吸道等细菌感染的主要原因，可导致局部化脓感染、肺炎甚至败血症等严重的感染性疾病。在过去的几十年里，金黄色葡萄球菌的感染率一直在增加，尤其是耐药和多耐药金黄色葡萄球菌的不断出现和传播，传统的抗生素治疗已经逐渐的失去作用，急需开发研究新型有效的生物绿色抑制剂来控制金黄色葡萄球菌。
[0004]噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染细菌后期表达的能够消化细菌细胞壁的一种酶。对于革兰氏阳性细菌，裂解酶还可以从外部通过破坏细菌细胞壁肽聚糖，导致细菌渗透性裂解，从而达到杀菌的效果。目前很多研究已经证实，裂解酶具有巨大的杀菌潜力。与传统的抗生素治疗相比，裂解酶的优势在于杀菌作用的高效性、特异性和安全性。根据其催化结构域在肽聚糖上的水解位点可将裂解酶分为至少5类：胞壁酸酶、裂解性转糖苷酶、N
‑
乙酰基
‑
β
‑
D
‑
氨基葡萄糖苷酶、N
‑
乙酰基胞壁酰
‑
L
‑
丙氨酸酰胺酶和内肽酶。<br/>[0005]金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶通常是由一个或两个N端的催化结构域和一个C端的结合结构域组成。最常见的催化结构域为CHAP(半胱氨酸和组氨酸依赖的酰胺水解酶)型，水解肽聚糖N
‑
乙酰基胞壁酸与L
‑
丙氨酸之间的酰胺键。C端的结合结构域通常属于SH3类型，能够靶向识别并结合细胞壁上特定的肽聚糖相关配体，增加酶与底物的接近度，保证酶的高度特异性。这种模块化结构域的组合方便人们利用蛋白工程等生物技术对裂解酶进行设计与改造，从而获得酶活性更高、裂解谱更广、更稳定的裂解酶。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其变体和应用。本专利技术从牛奶中分离出金黄色葡萄球菌噬菌体DZ25，并克隆、表达出裂解酶基因，命名为LysDZ25，研究它的一系列性质并进行理性设计，从而获得裂解活性和热稳定性均得到显著提高的突变体。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
[0007]具体的，本专利技术涉及以下技术方案：
[0008]本专利技术的第一方面，提供一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶，所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。经试验验证，该酶对大部分金黄色葡萄球菌都具有杀菌作用，为进一步提高该酶的杀菌活性和热稳定性作用，本专利技术对该酶进行理性设计，获得一系列酶突变体。
[0009]因此，本专利技术的第二方面，提供一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体，所述变体选自下组的一个或多个位点发生突变：A220L、S230E、V244L、N245R、D299L、N319L、S333V、S333I、S333L、K341P、N342E。
[0010]其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1(金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的氨基酸序列)所示的编号。
[0011]所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体在上述所示的野生型溶葡萄球菌酶基础上进行突变，并且所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体选自下组中的突变体：
[0012]突变体A：S333V；
[0013]突变体B：S333V/N245R；
[0014]突变体C：S333V/N245R/D299L。
[0015]本专利技术的第三方面，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述第一方面所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和/或第二方面所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体。
[0016]本专利技术的第四方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述第三方面所述的多核苷酸。
[0017]本专利技术的第五方面，提供一种细胞，所述细胞含有上述第四方面所述的重组表达载体或染色体整合有上述第三方面所述的多核苷酸或所述细胞表达上述第一方面所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和/或第二方面所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体。
[0018]本专利技术的第六方面，提供了一种生产上述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和/或变体的方法，包括步骤：培养上述第五方面的细胞，从而表达出所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和/或变体；以及分离纯化获得金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和/或变体。
[0019]本专利技术的第七方面，提供一种金黄色葡萄球菌抑制剂和/或灭杀剂，所述金黄色葡萄球菌抑制剂和/或灭杀剂包含上述第一方面所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶、第二方面所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体和/或第五方面所述细胞。
[0020]本专利技术的第八个方面，提供上述第一方面所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶、第二方面所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体、第三方面所述多聚核苷酸分子、第四方面所述重组表达载体、第五方面所述细胞、第七方面所述金黄色葡萄球菌抑制剂和/或灭杀剂在抗金黄色葡萄球菌领域中的应用。
[0021]本专利技术的第九个方面，提供第二方面所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体的设计方法，所述设计方法包括构建上述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的三维结构，并基于MDL方法预测金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体的热稳定性。
[0022]以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
[0023]上述技术方案提供了一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其变体和应用。本专利技术从牛奶中分离出一株金黄色葡萄球菌噬菌体DZ25，并克隆、表达出裂解酶基因，命名为LysDZ25，进而研究其性质并进行理性设计，获得一系列金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体，并通过实验验证筛选获得在高温条件下同样具有显著金黄色葡萄球菌裂解性能的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体，非常有助于实际生产生活应用，为开发控制金黄色葡萄球菌的新型有效的生物绿色抑制剂奠定了基础，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
[0024]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0025]图1为本专利技术实施例中DZ25基因的克隆与DZ25蛋白的表达纯化。(a)为DZ25基因表达情况图；(b)为DZ25蛋白表达情况图。
[0026]图2为本专利技术实施例中突变体设计策略图。
[0027]图3为本专利技术实施例中RoseTTAFold预测的LysDZ25三维结构及结构域拆分图。(a)为预测的LysDZ25三维结构图；(b)为LysDZ25结构域拆分图。
[0028]图4为本专利技术实施例中通过OD
600nm
浊度法测定LyzDZ25及其突变体的活性。(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体，其特征在于，所述变体选自下组的一个或多个位点发生突变：A220L、S230E、V244L、N245R、D299L、N319L、S333V、S333I、S333L、K341P、N342E；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和/或权利要求2所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求3所述的多核苷酸。5.一种细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求4所述重组表达载体或染色体整合有权利要求3所述多核苷酸或所述细胞表达上述第一方面所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和/或第二方面所述的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶变体。6.一种生产权利要求1所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶和/或权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢雪梅，祁庆生，苌妍，李庆宾，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：