【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及化学合成，具体而言，涉及一种5′-(e)-乙烯基磷酸酯的合成方法。
技术介绍
1、rna干扰是一种对双链rna的生物学反应，介导对内源性寄生和外源性致病核酸的抗性，并调节蛋白质编码基因的表达。近年来，rna干扰取得了一系列进展，基于rnai的治疗方法已经进入临床研究。然而，rnai疗法最大的影响因素是如何将sirna传送到目标细胞以及sirna在人体内的分解。
2、对sirna的修饰来改善其传递和稳定性成为目前研究的热点。报道使用5’-乙烯基磷酸盐修饰sirna能有效提高其稳定性。但是将乙烯基磷酸盐引入5’位羟基的合成方法却不多。
3、目前常见的5’-乙烯基亚磷酰胺单体合成路线如下（文献：j. med. chem. 2018,61, 3, 734–744. facile synthesis, geometry, and 2’-substituent-dependent invivo activity of 5’-(e)- and 5’-(z)-vinylphosphonate-modified sirnaconjugates）：
4、
5、目前该路线主要问题为化合物3的稳定性，该醛类化合物不稳定，后处理过程中遇水容易形成水合物，对后续反应有影响。且浓缩破坏反应发现该化合物浓缩过程中不稳定，容易变质导致放大收率明显降低。
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种5′-(e)-乙烯基磷酸酯的合成方法，以解决现有技术中5′-(
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种5′-(e)-乙烯基磷酸酯的合成方法。该合成方法包括以下步骤：使用moffatt氧化到后连投wittig反应，纯化后得到，脱tbs保护后得到，再投最后一步亚磷酰胺反应，制备得到，其中，b=a、t、g或c核酸碱基。
3、进一步地，使用moffatt氧化到的反应式为：
4、。
5、进一步地，使用moffatt氧化到包括：
6、第一反应釜中加入dmso和搅拌至全溶，降温至10~20℃，加入吡啶和三氟乙酸，随后加入二环己基碳二亚胺，保温反应；
7、第二反应釜中加入四氢呋喃和，搅拌至全溶后降温至-20~-10℃，加入碱，保温反应；
8、将第一反应釜中物料滴加到第二反应釜中，保温反应；
9、向第二反应釜中加入氯化铵水溶液淬灭反应；
10、采用mtbe对第二反应釜中的物料进行萃取，得到有机相。
11、进一步地，合成方法还包括对有机相进行纯化的步骤；
12、优选的，采用柱层析纯化有机相。
13、进一步地，第一反应釜中的dmso加入量为的体积的5~15倍，优选8~10倍，15~25℃搅拌至全溶；
14、优选的，吡啶的加入量为0.8~1.5当量，优选1当量，三氟乙酸的加入量为吡啶当量的一半；
15、优选的，加入吡啶和三氟乙酸，搅拌0.5~1h后，加入二环己基碳二亚胺；更优选的，二环己基碳二亚胺的加入量为1.5~2.0当量，进一步优选为1.6当量；
16、优选的，加入二环己基碳二亚胺后，第一反应釜的反应温度保持在0~25℃；更优选的，hplc跟踪至原料≤5%。
17、进一步地，第二反应釜中四氢呋喃的加入量为8~15v，优选10v，的加入量为1当量；
18、优选的，第二反应釜中的反应温度为-20~0℃℃；
19、优选的，第二反应釜中加入的碱为氢化钠、叔丁醇钾或叔丁醇钠中的一种或多种，优选为氢化钠；
20、更优选的，氢化钠的加入量为1.3 eq. 60%氢化钠；更优选的，加入氢化钠后保温反应的时间为0.5~1h；
21、优选的，将第一反应釜中物料滴加到第二反应釜中保温反应后取样跟踪hplc，每1~4h取样一次直至hplc跟踪至原料≤5%。
22、进一步地，第二反应釜中氯化铵水溶液的加入量为8~25v v，优选20 v，淬灭后搅拌0.5~1h；
23、优选的，采用mtbe对第二反应釜中的物料进行萃取包括：控温0~25℃，向第二反应釜中加入5~20 v，优选10v mtbe, 搅拌1~2h后静置分层后分液，水相再次使用5~20 v，优选10 v mtbe萃取，将得到的有机相合并后，使用5~10 v，优选5v饱和氯化钠水溶液反洗有机相；
24、优选的，有机相合并后，浓缩至1~2v，柱层析纯化有机相；更优选的，柱层析的流动相为庚烷/ipac，体积比10/1~1/1。
25、进一步地，脱保护基反应的反应式为：
26、。
27、进一步地，脱保护基反应包括：
28、向第三反应釜中加入甲酸、纯化水和有机相，将体系升温至45~55℃进行反应；
29、采用dcm对第三反应釜中的物料进行萃取，得到有机相。进一步地，第三反应釜中保持温度15~30℃，将5~15 v，优选12.5 v甲酸和5~15 v，优选12.5 v纯化水混匀，加入包含1当量的有机相；将体系升温至45~55℃，优选升温速度为5~15℃/h；其中，甲酸和纯化水的体积比为1:1，甲酸和纯化水的体积之和为15~30v；
30、保温45~55℃跟踪反应，hplc跟踪至≤2%且异构体≤1%；
31、将第三反应釜中体系温度降温至0~10℃，优选降温速度10~30℃/h；
32、控温0~10℃，向第三反应釜中加入氨水调ph~7；
33、控温0~20℃，加入5~15 v，优选10v dcm萃取，静置分液后再次使用5~15 v，优选10v dcm萃取后静置分液；
34、将有机相合并后控温t≤45℃，浓缩至1~2v；
35、柱层析过柱纯化得到。
36、可选的， 中的tbs基团替换为tbdps保护基。
37、应用本专利技术的技术方案，使用moffatt氧化（二环己基碳二亚胺和二甲亚砜氧化）到后连投wittig反应（省略了后处理过程，避免了加水后醛的水合以及产品醛的浓缩），两步连投得到wittig反应产物。因为wittig反应产物稳定性好，可以使用柱层析方法可以70%收率得到95%纯度以上的目标化合物。相较于现有方法（使用dess-martin试剂或者其他moffatt氧化方法），整个过程经济，环保，适合于放大生产。
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1.一种5′-(E)-乙烯基磷酸酯的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：使用moffatt氧化到后连投Wittig反应，纯化后得到，脱TBS保护后得到，再投最后一步亚磷酰胺反应，制备得到，其中，B=A、T、G或C核酸碱基。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述使用moffatt氧化到的反应式为：
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述使用moffatt氧化到包括：
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法还包括对所述有机相进行纯化的步骤。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，采用柱层析纯化所述有机相。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述第一反应釜中的DMSO加入量为的体积的5~15倍，15~25℃搅拌至全溶；和/或
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述第一反应釜中的DMSO加入量为的体积的8~10倍；和/或
8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述第二反应釜中四氢呋喃的加入量为8~15V，的加入量为1当量
9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述第二反应釜中四氢呋喃的加入量为10V；和/或
10.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述第二反应釜中氯化铵水溶液的加入量为8~25V，淬灭后搅拌0.5~1h；和/或
11.根据权利要求10所述的合成方法，其特征在于，所述第二反应釜中氯化铵水溶液的加入量为20 V；和/或
12.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述脱TBS保护的反应式为：
13.根据权利要求12所述的合成方法，其特征在于，所述TBS脱保护的反应式包括：
14.根据权利要求13所述的合成方法，其特征在于，所述第三反应釜中保持温度15~30℃，将5~15 V甲酸和5~15 V纯化水混匀，加入包含1当量的所述有机相；将体系升温至45~55℃，升温速度为5~15℃/h；其中，所述甲酸和所述纯化水的体积比为1:1，所述甲酸和所述纯化水的体积之和为15~30V；保温45~55℃跟踪反应，HPLC跟踪至≤2%且异构体≤1%；
15.根据权利要求14所述的合成方法，其特征在于，所述第三反应釜中保持温度15~30℃，将12.5 V甲酸和12.5 V纯化水混匀，加入包含1当量的所述有机相；和/或
16.根据权利要求1至15中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述中的TBS基团替换为TBDPS保护基。
...【技术特征摘要】
1.一种5′-(e)-乙烯基磷酸酯的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：使用moffatt氧化到后连投wittig反应，纯化后得到，脱tbs保护后得到，再投最后一步亚磷酰胺反应，制备得到，其中，b=a、t、g或c核酸碱基。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述使用moffatt氧化到的反应式为：
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述使用moffatt氧化到包括：
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法还包括对所述有机相进行纯化的步骤。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，采用柱层析纯化所述有机相。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述第一反应釜中的dmso加入量为的体积的5~15倍，15~25℃搅拌至全溶；和/或
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述第一反应釜中的dmso加入量为的体积的8~10倍；和/或
8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述第二反应釜中四氢呋喃的加入量为8~15v，的加入量为1当量；和/或
9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述第二反应釜中四氢呋喃的加入量为10v；和/或
【专利技术属性】
技术研发人员：李新南，张士民，闫伟，
申请(专利权)人：凯莱英生命科学技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：
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