一种基于食蟹猴APOBEC3A及其突变体的胞嘧啶碱基编辑器制造技术

本发明专利技术公开了一种基于食蟹猴APOBEC3A及其突变体的胞嘧啶碱基编辑器，属于基因工程技术领域。本发明专利技术构建的一系列CBE单碱基编辑器主要包含sgRNA、mA3A或其突变体、nCas9(D10A)、红色荧光蛋白、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂、高拷贝复制起点以及氨苄青霉素抗性筛选标记基因。本发明专利技术构建的单碱基编辑器的编辑窗口为C3

【技术实现步骤摘要】
一种基于食蟹猴APOBEC3A及其突变体的胞嘧啶碱基编辑器


[0001]本专利技术涉及一种基于食蟹猴APOBEC3A及其突变体的胞嘧啶碱基编辑器，属于基因工程


技术介绍

[0002]当前基因编辑技术不断快速发展，通过改造特定的基因，可以研究基因功能、遗传病的发病机理、开发新药以及用于基因治疗和改良作物等。近年来，基于CRISPR
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Cas系统的各种衍生技术更是广泛应用在生命科学和医学领域，其中的单碱基编辑器(Base editor,BE)已成为基因编辑技术的重要组成部分。BE是在CRISPR
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Cas9系统的基础上设计的，将野生型的Cas9蛋白进行改造后与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶连接，然后通过sgRNA(small guide RNA)的引导，在不产生DNA双链断裂(Double strandedbreak,DSB)的情况下直接进行单个碱基的编辑。BE主要分为两大类：胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine Base Editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine Base Editor,ABE)。2016年Dvid R Liu.团队开发的CBE系统中采用的胞嘧啶脱氨酶可将非互补链中相应的胞嘧啶(Cytosine,C)经过脱氨基作用变为尿嘧啶(Uracil，U)，在DNA复制或修复的过程中U被识别为胸腺嘧啶(Thymine，T)，而互补链上相对应的鸟嘌呤(Guanine,G)将会变成腺嘌呤(Adenine,A)，最终实现非互补链上C>T和互补链上G>A的转换。2017年，DvidRLiu.团队又开发ABE系统，原理和CBE系统相似，只是将胞嘧啶脱氨酶换成了腺嘌呤脱氨酶，可以完成非互补链上A>G和互补链上T>C的编辑，进一步补充了单碱基编辑器的类型。
[0003]BE系统中的Cas9蛋白可进一步优化，一种是可结合靶基因但不切割靶基因的无核酸内切酶活性的dCas9(Catalytically dead Cas9)，另一种是具有单链DNA切口酶活性的nCas9(Cas9 nickase)，两种Cas9蛋白均不会产生DBS，从而避免了非同源末端连接(Non
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homologous end
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joining,NHEJ)的错配，也不用考虑同源重组修复(Homology
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directedrepair,HDR)的低效率问题。随后又在BE中加入了尿嘧啶糖基化酶抑制剂(uracil glycosylase inhibitor,UGI)可抑制中间产物U的切除，提高了DNA链上C>T的编辑效率。目前，BE系统发展迅速，CBE系统已优化到第四代BE4，ABE系统也优化到ABE7.10版本，甚至开发出一些将CBE和ABE系统功能融合的双碱基编辑器，可在相同的靶位点同时实现C>T和A>G的转换。
[0004]传统的CBE系统中采用的胞嘧啶脱氨酶是大鼠的Apobec1(rA1)，Jason M Gehrke等人2018年时尝试采用人的改造后的APOBEC3A(eA3A)去替换第三代CBE系统(BE3)中的rA1，他们将人的APOBEC3A(hA3A)进行定点突变构建了一系列携带hA3A单个氨基酸突变的BE3突变体编辑器，其中hA3A
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N57G的靶向(HBB
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28
位点)编辑效率较高且旁(HBB
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25
位点)编辑效率在这一系列突变体中最低。随后他们将携带hA3A
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N57G的BE3用于β
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地中海贫血的治疗研究，将其编辑的精确度与BE3相比提高了将近40倍，但是在HBB
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28
位点的编辑效率只有30％左右。
[0005]由于单基因遗传病的致病突变大部分为点突变，而BE系统可以针对DNA序列的单
个碱基进行编辑，从而对遗传病人的致病位点突变进行修正，实现“分子手术”，在致病的物质基础上对遗传病进行根治。且已知大约有75000个人类基因组位点突变和遗传疾病有关，其中估计有约50％是CBE系统潜在的治疗靶点。因此，开发更高效、准确的单碱基编辑器并进行优化，对单基因遗传病的治疗具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0006]现有的CBE系统中采用的胞嘧啶脱氨酶大多是大鼠的Apobec1(rA1)，少数是人的APOBEC3A(hA3A)和APOBEC3G(hA3G)，暂无非人灵长类动物食蟹猴的胞嘧啶脱氨酶在CBE系统中的应用。
[0007]为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种编辑效率高，产物纯度高，编辑窗口灵活的基因编辑工具。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种食蟹猴来源的胞嘧啶脱氨酶的突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的亲本酶的基础上，将第137位苯丙氨酸突变为脯氨酸，第123位蛋氨酸突变为缬氨酸，第111位谷氨酸突变为甘氨酸和/或第77位半胱氨酸突变为精氨酸。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供编码上述胞嘧啶脱氨酶突变体的基因。
[0010]在一种实施方式中，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供一种表达盒，所述表达盒包含上述编码上述胞嘧啶脱氨酶突变体的基因。
[0012]在一种实施方式中，所述表达盒还含有启动子、nCas9(D10A)、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)、核定位序列NLS、终止序列。
[0013]在一种实施方式中，所述启动子启动编码上述胞嘧啶脱氨酶突变体的基因表达，按连接顺序依次为启动子、所述胞嘧啶脱氨酶突变体、nCas9(D10A)、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)、核定位序列NLS和终止序列。
[0014]在一种实施方式中，所述启动子包括但不限于CMV启动子和Amp启动子。
[0015]在一种实施方式中，所述nCas9(D10A)的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，UGI的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述NLS的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述终止序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0016]本专利技术的第四个目的是提供一种CBE单碱基编辑系统，所述CBE单碱基编辑系统共包含四个部分，第一部分为转染效率指示部分，包含红色荧光蛋白(dTomato)和启动子；第二部分为sgRNA转录单元，包含插入sgRNA序列的携带框架及其启动子；第三部分包含上述表达盒，第四部分包含来自大肠杆菌素因子(colE1)的高拷贝复制起点ori以及氨苄青霉素抗性筛选基因AmpR。
[0017]在一种实施方式中，所述启动子包括CMV启动子和U6启动子。
[0018]在一种实施方式中，红色荧光蛋白的核苷酸序列如SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胞嘧啶脱氨酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的亲本酶的基础上，将第137位苯丙氨酸突变为脯氨酸，第123位蛋氨酸突变为缬氨酸，第111位谷氨酸突变为甘氨酸和/或第77位半胱氨酸突变为精氨酸。2.编码权利要求1所述胞嘧啶脱氨酶突变体的基因。3.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒还含有启动子、nCas9(D10A)、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂、核定位序列和终止序列；所述启动子启动权利要求2所述基因的表达，按连接顺序依次为启动子、权利要求2所述基因、nCas9(D10A)、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂、核定位序列、终止序列。5.根据权利要求3或4所述的表达盒，其特征在于，所述nCas9(D10A)的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述核定位序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述终止序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。6.一种基于食蟹猴胞嘧啶脱氨酶的CBE单碱基编辑...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建欢，任春艳，刘彦山，饶义剑，潘佳琪，何雨珊，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：