突变的无激活作用的IgG2结构域和插入该结构域的抗CD3抗体制造技术

本发明专利技术提供了突变的ＩｇＧ２恒定区和插入了该区的抗ＣＤ３抗体。这样的抗体可与Ｔ细胞上的ＣＤ３抗原特异结合，但与另一种具有天然ＩｇＧ２恒定区而其余部分与所述抗体相同的抗体相比，其诱导的促有丝分裂反应有所降低。该抗体可以用于治疗需要免疫抑制功能的疾病，并且治疗时比原先的ＣＤ３抗体副作用更小。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术应用免疫和分子遗传技术，设计突变的无激活作用的IgG2结构域和插入该结构域的人源化抗CD3抗体。
技术介绍
T细胞上的CD3复合物与T细胞受体(T cell receptor,TCR)异质二聚体密切相关，在抗原结合而激活T细胞的过程中起重要作用。某些抗CD3抗体能在无抗原的情况下激活T细胞。这种激活依赖于单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的Fc部分和辅佐细胞上Fc受体的相互作用以交联T细胞上的CD3复合物。可溶性的抗CD3单克隆抗体不会刺激T细胞体外增殖，除非它们结合于塑料或含有Fc受体的细胞上。虽然给人类受试者或小鼠服用这种抗体会产生免疫抑制作用，但功效却常受两种因素影响，其一是由于多次注射外源蛋白而导致的抗球蛋白反应，其二是由于T细胞活化导致的首次给药症状。这些症状包括发烧、寒颤、腹泻和呕吐，严重情况下可以导致死亡。这种症状是由于T细胞短暂激活而释放大量细胞因子所造成(参见Abramowicz等，移植，47,606,(1989))。一直认为TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-4、IL-6和GM-CSF等细胞因子可能与这些严重副作用有关。对于小鼠，曾报道两种形式的抗CD3抗体具有免疫抑制作用而不激活小鼠T细胞，这两种形式是F(ab’)2形式(参见Hirsch等，移植，49,1117,(1990))和小鼠IgG3同种型的嵌合形式(参见Alegre等，免疫学杂志，155,1544,(1995))。前者缺乏与Fcγ受体结合的恒定区部分，后者的恒定区与小鼠Fcγ受体亲合力很低。在人类治疗中，期望得到一种人源化且不与Fcγ受体相互作用的抗CD3分子以将免疫原性和毒性减至最小。已经分别确定了各种人IgG同种型与三种Fcγ受体--FcRⅠ,FcRⅡ和FcRⅢ的亲合性(参见Raretch和Kinet，免疫学年鉴，9,457,(1991))。FcRⅠ是一种高亲合受体，它以单体形式与IgG结合；后两者是低亲合受体，它们以多聚体形式与IgG结合。通常IgG1和IgG3与三种受体都有显著的结合活性，IgG4与FcRⅠ、IgG2仅与FcRⅡ中称为ⅡaLR的一种类型有显著的结合活性(参见Parren等，免疫学杂志，148,695(1992)；临床研究杂志，90,1537(1992))。ⅡaLR是FcRⅡ的一种等位基因，其在40％的Caucasian群体中有表达。几个研究者制备了各种同种型的嵌合型抗CD3，但报道至少在几个捐献者中它们有促PBMC(外周血单核细胞)分裂的作用(参见Bolt等，欧洲免疫学杂志，23,403,(1993)；Parren等，研究免疫学，143,793(1991))。因此，Fc的天然存在形式不适于产生无激活作用的抗CD3单克隆抗体。曾报道抗CD3的IgG1和IgG4的下部铰链区或上部CH2区发生突变能使这些分子的促有丝分裂性降低(参见Alegre等，移植，57,1537(1994)；Alegre等，免疫学杂志，148,3461(1991))。据报道IgG3的235位突变能影响它与FcRⅠ的相互作用，234和237位的突变影响它与FcRⅡ的相互作用(参见Lund等，免疫学杂志，147,2657,(1991))。未被糖基化的抗CD3也被报道与Fcγ受体的结合性有所削弱(参见Bolt等，欧洲免疫学杂志，23,403(1993))。尽管有这些进展，仍然需要在恒定区有突变从而与现有抗体相比将促有丝分裂作用限制在更小范围内和更少病人中的抗CD3抗体。专利技术概述本专利技术涉及一种突变的IgG2恒定区，它在234和237位残基(按EU编号系统定义)之间含有非天然存在的氨基酸区段。插入这样的IgG2恒定区的抗CD3抗体能与T细胞上的CD3抗原特异性结合，而且不会由于与Fcγ受体特异性结合而引起T细胞的促有丝分裂反应。突变的IgG2恒定区234、235和237位残基优选下列各氨基酸序列之一ala alagly、val ala ala、ala ala ala、val glu ala和ala glu ala。需注意这些突变恒定区中不包括236位(按EU编号系统定义)，如同野生型IgG2恒定区的情况。通常，突变区段包含在除此不同外即为天然存在的人IgG2恒定区内。本专利技术还提供了插入了该突变的IgG2恒定区的抗CD3抗体，优选人源化抗体。本专利技术进一步提供了来源于小鼠M291抗体的新的人源化抗体，其中插入了突变的IgG2结构域。优选的人源化抗体轻链含有三个互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和一个来源于人κ轻链可变区框架序列的可变区框架，所说的三个互补性决定区具有M291免疫球蛋白轻链相应互补性决定区的氨基酸序列。优选的人源化抗体重链包括三个互补性决定簇(CDR1、CDR2和CDR3)和一个可变区框架，所说的三个互补性决定区具有M291免疫球蛋白重链相应互补性决定区的氨基酸序列，所说的可变区框架来源于人重链可变区框架序列，除了其至少在H30、H67、H68、H70、H72和H74之一的氨基酸位置由小鼠M291免疫球蛋白重链可变区框架同一位置的同样氨基酸所占据。这种免疫球蛋白与T细胞表面的CD3抗原特异性结合，通常其亲合力下限约107M-1，上限约为M291免疫球蛋白结合亲合力的5倍。最好该人源化轻链可变区框架来自亚组Ⅰ的HF2-1/17抗体的轻链可变区框架。人源化重链可变区框架以来自21/28抗体的重链可变区框架为佳。这种情况下，H44位可以由人免疫球蛋白亚组Ⅰ的共有序列同一位置上的同样氨基酸所替代。附图简述附图说明图1小鼠(A-B)或人源化(C-D)M291抗体的轻链(A、C)和重链(B、D)可变区cDNA序列(SEQ ID NO:1、3、5、7)和翻译成的氨基酸序列(SEQ ID NO:2、4、6、8)。每一成熟链的第一个氨基酸用双下划线表示。每条链的三个CDR用下划线表示。图2表达嵌合型抗CD3抗体的质粒构建体。将OKT3的Vh和VLcDNA制成两侧含有XbaⅠ位点的外显子。将VL序列插入到表达载体pVk.rg中，将VH序列插入到重链表达载体pVg2.D.Tt中。然后对这两个质粒进行重组以产生共表达重链和轻链的单一质粒。在这些质粒中PstⅠ和SfiⅠ位点不是单一的。图3四种人IgG同种型、五种IgG2突变体和一种IgG4突变体的CH2区内的序列。依照EU编号系统对残基进行编号。图4IgG2突变体3重链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。CH1结构域由残基118-215组成，绞链区由残基216-230组成，CH2结构域由残基231-340组成，CH3结构域由残基341-447组成。符号“-”表示为用EU正确排列而引入的间隔。由野生型IgG2突变而来的残基用下划线标出。除残基234-237外，所有五种IgG2突变体都有相同的序列。图3给出了五种突变体在该区域内的序列。所有残基均按EU编号系统编号。图5与嵌合型OKT3抗CD3抗体有关的T细胞增殖。确定了由嵌合型抗CD3抗体诱导的来自八个人捐献者(供体A-H)的PBMC中胸苷的掺入量。将PBMC分别与浓度为10ng/ml、100ng/ml和1μg/ml的每一种抗CD3抗体共培养72小时，然后加入胸苷脉冲标记12小时，由本文档来自技高网...

【技术保护点】
在按ＥＵ编号系统定义的残基２３４和２３７位间具有非天然存在的氨基酸区段的突变ＩｇＧ２恒定区，其中含有一种抗ＣＤ３抗体的可变区与所述突变ＩｇＧ２恒定区相连的抗体相对于含有所述抗ＣＤ３抗体的可变区与一种天然ＩｇＧ２恒定区相连的另一种抗体而言，前者所诱导的人Ｔ细胞的促有丝分裂反应有所降低。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JY特索，MS科勒，C阿纳瑟迪，
申请(专利权)人：菲赛特生物技术公司，弗雷德哈钦森癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：US[美国]