本发明专利技术公开了一种制备人纤维蛋白原制剂的方法，该方法以健康人血浆为原料，经低温乙醇蛋白分离法分离纯化，其中采用温和的压滤法替代了离心法，并用低温乙醇溶液对沉淀进行顶洗；增加了多级深层过滤；改进了冻干工艺，使冻干周期由4～8天缩短到2～3天；并将S/D法、UVC照射法和干热法结合对病毒进行灭活处理，保证了对脂包膜、非脂包膜病毒尤其是耐热的细小病毒的去除效果。本发明专利技术还公开了由上述方法制备的人纤维蛋白原制剂。本发明专利技术生产出的人纤维蛋白原制剂质量更稳定，杂质含量更低，病毒安全性更高，能最大限度的减少输注该制剂可能给患者带来的安全风险，降低了临床应用时副反应的发生，使用药更安全。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及血液制品领域，特别是涉及一种制备人纤维蛋白原制剂的方法及其制备的制剂。
技术介绍
纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)，即凝血因子Ⅰ(FⅠ)，是凝血系统中的“中心”蛋白质之一，相对分子量340kDa，具有2964(6)个氨基酸残基，分子长度约为45nm，宽度最大直径为4.8nm，半衰期为96～144小时，等电点为5.1～5.5，沉降系数为7.7～7.9。Fg主要由肝脏合成，是一种糖蛋白，含碳水化合物3％～5％，由两个相同部分组成，每个部分含有3条肽链，即Aα、Bβ和γ链，分别由610、461和410个氨基酸残基构成。每部分由12个二硫键相连，两个部分之间通过两条γ链的半胱氨酸8、9及Aα链的半胱氨酸28所形成的3个二硫键在氨基端相连。大部分存在于人体血浆中，约15％存在于血管外，正常人血浆中Fg的含量为2.0～4.0g/L，是血浆粘滞性的主要决定因素，止血需要量约为正常的25％～50％，血浆水平低于1～1.5g/L可能引起凝血障碍。纤维蛋白原在凝血酶的作用下裂解释放纤维蛋白肽A和B，形成纤维蛋白，与血小板一起形成稳固的纤维蛋白血栓，完成止血机制。Fg是由健康人血浆经分离、提纯并经病毒灭活处理制成的，主要应用于先天性、获得性纤维蛋白原减少症、严重肝脏损伤、肝硬化、DIC以及手术或者产后大出血等的治疗，是临床上用于大出血止血的必备急救药品之一。其制备方法直接影响产品的质量和安全性。早在20世纪40年代，采用Cohn低温乙醇法分离出来的Fg制品就已应用于临床；但当时Fg制品的生产工艺中尚不含对制品的病毒灭活处理，这导致患者在输注后引起病毒性肝炎的危险性很大，一些欧美国家相继停止了Fg制品的制备与应用。美国FDA于1977年12月撤销了Fg制品的生产许可证，并于1978年7月禁止其使用。20世纪8O年代以后，Fg制品病毒灭活方法的研究取得成功，使该制品又重新开始生产。2002年国家食品药品督管理局(SFDA)发布《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导》，要求在凝血因子类制品的生产过程中，应有特定的能去除/灭活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，以减少产品携带病毒的风险，确保制品的安全。目前，国内上市的Fg制品均为S/D法联合干热法进行病毒灭活，但S/D法仅能灭活脂包膜病毒如危害性较大的HBV、HCV和HIV等，对人细小病毒(B19)、HAV等非脂包膜病毒无杀灭作用。干热法即冻干制剂经过加热处理杀灭病毒的方法，目前采用较多的是100℃30min干热处理，该法已被证明能有效灭活HBV、HCV、HIV等脂包膜病毒及EMCV、HAV等非脂包膜病毒，其病毒灭活效果已为实验室验证和临床应用所肯定，为控制凝血因子类制品病毒感染发挥了重要作用，但早在1997年就有过8名血友病患者采用经100℃30min干热法灭活的凝血因子制品治疗后感染B19的报道；2005年Prikhod’ko等的研究显示，残留水分为0.5％～0.7％的人纤维蛋白原，经100℃3h干热法灭活处理后，B19病毒仅降低(2～3)log。可见干热法对B19等耐热性非脂包膜病毒有一定灭活效果，但无法完全阻断B19的传染，存在一定风险。针对B19这类耐热性较强的非脂包膜病毒，还应与其他灭活方法结合使用，以确保制品的安全性。由此可见，上述现有的制备人纤维蛋白原制剂的方法显然仍存在有不足，而亟待进一步改进。如何能创设一种制备的人纤维蛋白原制剂纯度高、稳定性高、病毒灭活效果好的新的方法及其制备的制剂，为当前重要研发课题之一。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种制备人纤维蛋白原制剂的方法及其制备的制剂，使其制得的人纤维蛋白原制剂纯度高、稳定性高、病毒灭活效果好，从而克服现有的制备人纤维蛋白原制剂方法的不足。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种制备人纤维蛋白原制剂的方法，制备方法步骤如下：(1)分离组分I：将病毒检测合格并且符合国家检疫期规定的原料血浆,在温度0℃±2.5℃、乙醇浓度8～10％、pH7.0±0.20条件下，搅拌1～3小时，然后通过压滤法分离出组分I；(2)洗涤/溶解组分I：将组分I沉淀粉碎后，加入体积升数为组分I千克数20±5倍的枸橼酸钠-甘氨酸缓冲液中，在温度0℃±2.5℃条件下搅拌洗涤30～60分钟，通过压滤法分离出洗涤后的沉淀A，将该沉淀A粉碎，加入到体积升数为沉淀A千克数3～5倍的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸钠缓冲液中，在温度20℃～30℃的条件下搅拌溶解1～3小时，用三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸钠缓冲液稀释至体积升数为沉淀A千克数的10～12倍，澄清过滤，取滤液备用；(3)S/D灭活处理：计量步骤(2)得到的滤液体积后，在搅拌过程中，加入1/10滤液体积的S/D溶液，所述S/D溶液含110g/L聚山梨酯80和33g/L磷酸三丁酯，温度20℃～30℃，调制溶液pH至7.00±0.20，并在水浴24℃～26℃的条件下缓慢搅拌灭活4～8小时；(4)乙醇沉淀：将步骤(3)得到的溶液澄清过滤后，降温至0℃～2℃，在搅拌过程中，加入预冷至-5℃以下的50％乙醇溶液，使溶液中乙醇终含量为8％～10％，并调整温度至-2℃～2℃，pH至7.00±0.20，搅拌反应0.5～1.5小时，通过压滤法分离出沉淀B，将沉淀B加入到体积升数为沉淀B千克数13～15倍的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸钠缓冲液中，保持温度30℃～37℃，搅拌溶解0.5～1.5小时，澄清过滤，重复本步骤上述操作一次，通过压滤法分离出沉淀C；(5)原液制备：将沉淀C粉碎后，加入到体积升数为沉淀C千克数4～8倍的盐酸精氨酸-枸橼酸钠缓冲液中，在30℃～37℃的条件下搅拌溶解0.5～1.5小时，澄清过滤后，用盐酸精氨酸-枸橼酸钠缓冲液调整溶液中蛋白质含量至2.2％～3.0％，调整pH值为6.5～7.5，得原液；(6)UVC照射处理：将原液放置于UVC灭活仪中，经强度为90～140J/m2UVC照射处理；(7)除菌过滤及分装。作为本专利技术的进一步改进，所述方法还包括：将步骤(7)得到的分装样品冻干，所述冻干过程中包括预冷、退火操作步骤。进一步改进，所述冻干步骤为：5℃预冷1h、-40℃冻结3h、-10℃～-5℃退火2h、-40℃冻结3h、-5℃～0℃升华20h、20℃～25℃升温干燥10h～20h，真空封口，且冻干过程中制品温度不超过30℃。进一步改进，所述方法还包括：将所得的冻干制剂经沸水浴本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备人纤维蛋白原制剂的方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：(1)分离组分I：将病毒检测合格并且符合国家检疫期规定的原料血浆,在温度0℃±2.5℃、乙醇浓度8～10％、pH7.0±0.20条件下，搅拌1～3小时，然后通过压滤法分离出组分I；(2)洗涤/溶解组分I：将组分I沉淀粉碎后，加入体积升数为组分I千克数20±5倍的枸橼酸钠‑甘氨酸缓冲液中，在温度0℃±2.5℃条件下搅拌洗涤30～60分钟，通过压滤法分离出洗涤后的沉淀A，将该沉淀A粉碎，加入到体积升数为沉淀A千克数3～5倍的三羟甲基氨基甲烷‑枸橼酸钠缓冲液中，在温度20℃～30℃的条件下搅拌溶解1～3小时，用三羟甲基氨基甲烷‑枸橼酸钠缓冲液稀释至体积升数为沉淀A千克数的10～12倍，澄清过滤，取滤液备用；(3)S/D灭活处理：计量步骤(2)得到的滤液体积后，在搅拌过程中，加入1/10滤液体积的S/D溶液，所述S/D溶液含110g/L聚山梨酯80和33g/L磷酸三丁酯，温度20℃～30℃，调制溶液pH至7.00±0.20，并在水浴24℃～26℃的条件下缓慢搅拌灭活4～8小时；(4)乙醇沉淀：将步骤(3)得到的溶液澄清过滤后，降温至0℃～2℃，在搅拌过程中，加入预冷至‑5℃以下的50％乙醇溶液，使溶液中乙醇终含量为8％～10％，并调整温度至‑2℃～2℃，pH至7.00±0.20，搅拌反应0.5～1.5小时，通过压滤法分离出沉淀B，将沉淀B加入到体积升数为沉淀B千克数13～15倍的三羟甲基氨基甲烷‑枸橼酸钠缓冲液中，保持温度30℃～37℃，搅拌溶解0.5～1.5小时，澄清过滤，重复本步骤上述操作一次，通过压滤法分离出沉淀C；(5)原液制备：将沉淀C粉碎后，加入到体积升数为沉淀C千克数4～8倍的盐酸精氨酸‑枸橼酸钠缓冲液中，在30℃～37℃的条件下搅拌溶解0.5～1.5小时，澄清过滤后，用盐酸精氨酸‑枸橼酸钠缓冲液调整溶液中蛋白质含量至2.2％～3.0％，调整pH值为6.5～7.5，得原液；(6)UVC照射处理：将原液放置于UVC灭活仪中，经强度为90～140J/m2UVC照射处理；(7)除菌过滤及分装。...
【技术特征摘要】
1.一种制备人纤维蛋白原制剂的方法，其特征在于，所述制备方法步
骤如下：
(1)分离组分I：将病毒检测合格并且符合国家检疫期规定的原料血
浆,在温度0℃±2.5℃、乙醇浓度8～10％、pH7.0±0.20条件下，搅拌1～
3小时，然后通过压滤法分离出组分I；
(2)洗涤/溶解组分I：将组分I沉淀粉碎后，加入体积升数为组分I
千克数20±5倍的枸橼酸钠-甘氨酸缓冲液中，在温度0℃±2.5℃条件下搅
拌洗涤30～60分钟，通过压滤法分离出洗涤后的沉淀A，将该沉淀A粉碎，
加入到体积升数为沉淀A千克数3～5倍的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸钠缓
冲液中，在温度20℃～30℃的条件下搅拌溶解1～3小时，用三羟甲基氨基
甲烷-枸橼酸钠缓冲液稀释至体积升数为沉淀A千克数的10～12倍，澄清
过滤，取滤液备用；
(3)S/D灭活处理：计量步骤(2)得到的滤液体积后，在搅拌过程中，
加入1/10滤液体积的S/D溶液，所述S/D溶液含110g/L聚山梨酯80和33g/L
磷酸三丁酯，温度20℃～30℃，调制溶液pH至7.00±0.20，并在水浴24
℃～26℃的条件下缓慢搅拌灭活4～8小时；
(4)乙醇沉淀：将步骤(3)得到的溶液澄清过滤后，降温至0℃～2
℃，在搅拌过程中，加入预冷至-5℃以下的50％乙醇溶液，使溶液中乙醇终
含量为8％～10％，并调整温度至-2℃～2℃，pH至7.00±0.20，搅拌反应0.5
～1.5小时，通过压滤法分离出沉淀B，将沉淀B加入到体积升数为沉淀B
千克数13～15倍的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸钠缓冲液中，保持温度30℃～
37℃，搅拌溶解0.5～1.5小时，澄清过滤，重复本步骤上述操作一次，通
过压滤法分离出沉淀C；
(5)原液制备：将沉淀C粉碎后，加入到体积升数为沉淀C千克数4～
8倍的盐酸精氨酸-枸橼酸钠缓冲液中，在30℃～37℃的条件下搅拌溶解0.5
～1.5小时，澄清过滤后，用盐酸精氨酸-枸...
【专利技术属性】
技术研发人员：马小伟，梁雪爽，张学成，谢来峰，李冠军，王学位，
申请(专利权)人：华兰生物工程股份有限公司，华兰生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41
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