一种高产荚膜多糖的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高产荚膜多糖的制备方法。本发明专利技术提供了一种培养19A型肺炎链球菌的方法，包括如下步骤：将19A型肺炎链球菌接种到发酵培养基中进行发酵培养；所述发酵培养基中的碳源为乳糖、葡萄糖或半乳糖；所述发酵培养基中含有微量元素；所述微量元素有Mg

【技术实现步骤摘要】
一种高产荚膜多糖的制备方法


[0001]本专利技术涉及药物领域，具体涉及一种高产荚膜多糖的制备方法。

技术介绍

[0002]肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)为革兰氏阳性菌，由细胞质、细胞膜、细胞壁及由表面蛋白和荚膜多糖组成的荚膜构成，其中荚膜多糖、表面蛋白和组成细胞壁的肽聚糖为肺炎链球菌的主要毒力因子。肺炎链球菌常寄居在呼吸系统中，是社区获得性肺炎、脑膜炎、中耳炎、支气管炎和败血症的主要病原体。正常情况下可通过纤毛运输、黏膜分泌和咳嗽等机体免疫反应清除掉，当机体免疫力下降时，可感染肺部和血液，从而引起肺炎和败血症。1875年Klebs最早对肺炎链球菌进行描述，1881年Pasteur和Sternberg首次从患者痰液中将其分离，1932年Cooper分离出30多个血清型的肺炎链球菌。随着不断的深入研究，已经揭示出肺炎链球菌的致病机理，当肺炎链球菌进入肺部和血液后，人体免疫系统被激活，产生大量的肺泡巨噬细胞和中性粒细胞，进行吞噬作用，人体B细胞产生荚膜多糖抗体，与肺炎链球菌上的荚膜多糖特异性结合，形成凝集物而使其失去侵染力，最后被吞噬细胞吞噬和分解掉。
[0003]目前已经发现至少91个血清型肺炎链球菌，流行病学显示，不同地区各血清型的发病情况不同，欧美地区18C型发病率较高，非洲和亚洲地区1、5、6A、6B、14、19F和23F型发病率较高，特别是随着抗生素的滥用，研发和生产肺炎疫苗已成为预防肺炎链球菌感染的最有效措施。1911年Wright研发出全菌体肺炎链球菌疫苗，用于预防南非金矿矿工的大叶性肺炎，因不良反应大，预防效果差，最终终止了其使用。随着对肺炎链球菌的研究，特别是其主要毒力因子和致病机理的发现，极大的推动了肺炎疫苗的研发，其中荚膜多糖逐渐成为科研的热点。1945年首支4价肺炎链球菌多糖疫苗上市，但由于当时抗生素的兴起，并未被大规模使用。随着抗生素的滥用，肺炎链球菌的耐药性大幅度增强，肺炎疫苗的研发再次被重视起来。1978年经FDA批准，一种14价肺炎多糖疫苗上市，在此基础上，1983年包含着1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F共23个血清型的23价肺炎多糖疫苗(23
‑
Valent pneumococcal polysaccharide vaccine，PPV23)经FDA批准上市。参照PPV23，我国目前已完成了23价肺炎多糖疫苗的研发与生产，并已成功上市。由于2岁以下婴幼儿体内免疫系统并未成熟，单独使用荚膜多糖很难有效诱发其产生抗体，所以肺炎多糖疫苗只能用于2岁以上人群的预防。1929年Avery和Goebel提出将细菌多糖与载体蛋白偶联，可诱导机体产生针对于偶联体更强烈的免疫反应，多糖蛋白结合疫苗逐渐进入人们的视野。2000年Wyeth公司使用还原胺化法将肺炎多糖与白喉毒素突变体(CRM
197
)连接，成功研发出了包括4、6B、9V、14、18C、19F和23F共7个血清型的肺炎多糖蛋白结合疫苗Prevenar，并获批准上市。2010年Wyeth公司在Prevenar的基础上又增加了1、2、5、6A、19A和7F共6个血清型，成功上市了Prevenar13。
[0004]通过传统的方法对肺炎链球菌进行培养，有一些血清型的菌株不能很好的生长，有的虽能较好生长但多糖产量不高，有的生长和多糖产量没问题但多糖质量不达标，因此
开发新的培养方法成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种高产荚膜多糖的19A型肺炎链球菌的培养方法。
[0006]第一方面，本专利技术要求保护一种培养19A型肺炎链球菌的方法。
[0007]本专利技术所要求保护的培养19A型肺炎链球菌的方法，可包括如下步骤：将19A型肺炎链球菌接种到发酵培养基中进行发酵培养。
[0008]所述发酵培养基中的碳源为乳糖、葡萄糖或半乳糖。
[0009]所述发酵培养基中含有微量元素；所述微量元素有Mg
2+
、Mn
2+
、Zn
2+
、Cu
2+
和Fe
3+
。
[0010]在进行所述发酵培养过程中，按照如下控制发酵体系的pH：控制前期pH7.5
±
0.5，稳定期pH6.5
±
0.5。前期pH比稳定期pH高0.85
‑
1。如前期pH7.45，稳定期pH6.48
‑
6.6。所述稳定期为发酵体系的OD
600
为1.5
±
0.2(自培养开始约4h后进入稳定期)。
[0011]进一步地，所述发酵培养基中乳糖的含量为7.5
±
0.5g/L(如7.5g/L)。或，所述发酵培养基中葡萄糖的含量为7.5
±
0.5g/L(如7.5g/L)。或，所述发酵培养基中半乳糖的含量为7.5
±
0.5g/L(如7.5g/L)。
[0012]进一步地，所述发酵培养基中，Mg
2+
含量为0.88
±
0.05mmol/L，Mn
2+
含量为2.15
±
0.05mmol/L，Zn
2+
含量为0.17
±
0.05mmol/L，Cu
2+
含量为0.06
±
0.05mmol/L，Fe
3+
含量为0.74
±
0.05mmol/L。
[0013]更进一步地，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：胰蛋白胨17
±
5g/L；大豆胨3
±
1g/L；酵母浸粉4
±
1g/L；氯化钠5
±
1g/L；磷酸氢二钾3.27
±
0.5g/L；乳糖7.5
±
0.5g/L；硫酸镁(含6分子结合水)0.2
±
0.1g/L；氯化锰(含4分子结合水)0.425
±
0.1g/L；氯化铁(含6分子结合水)0.2
±
0.1g/L，硫酸锌(含7分子结合水)0.05
±
0.01g/L；硫酸铜(含5分子结合水)0.015
±
0.005g/L。
[0014]在本专利技术的具体实施方式中，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：胰蛋白胨17g/L；大豆胨3g/L；酵母浸粉4g/L；氯化钠5g/L；磷酸氢二钾3.27g/L；乳糖7.5g/L；硫酸镁(含6分子结合水)0.2g/L；氯化锰(含4分子结合水)0.425g/L；氯化铁(含6分子结合水)0.2g/L，硫酸锌(含7分子结合水)0.05g/L；硫酸铜(含5分子结合水)0.015g/L。
[0015]进一步地，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养19A型肺炎链球菌的方法，包括如下步骤：将19A型肺炎链球菌接种到发酵培养基中进行发酵培养；所述发酵培养基中的碳源为乳糖、葡萄糖或半乳糖；所述发酵培养基中含有微量元素；所述微量元素有Mg
2+
、Mn
2+
、Zn
2+
、Cu
2+
和Fe
3+
；在进行所述发酵培养过程中，按照如下控制发酵体系的pH：控制前期pH7.5
±
0.5，稳定期pH6.5
±
0.5。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中乳糖的含量为7.5
±
0.5g/L；和/或所述发酵培养基中，Mg
2+
含量为0.88
±
0.05mmol/L，Mn
2+
含量为2.15
±
0.05mmol/L，Zn
2+
含量为0.17
±
0.05mmol/L，Cu
2+
含量为0.06
±
0.05mmol/L，Fe
3+
含量为0.74
±
0.05mmol/L。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：胰蛋白胨17
±
5g/L；大豆胨3
±
1g/L；酵母浸粉4
±
1g/L；氯化钠5
±
1g/L；磷酸氢二钾3.27
±
0.5g/L；乳糖7.5
±
0.5g/L；六水合硫酸镁0.2
±
0.1g/L；...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨赢，安文琪，郝一楠，梁雪爽，王亚萍，张学成，赵东生，
申请(专利权)人：华兰生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：