包含纤维蛋白原结合肽的肽类树状聚合物制造技术

描述了肽类树状聚合物和试剂，其可用于使纤维蛋白原聚合并且可用作止血剂。所述肽类树状聚合物包含分支核心和多个与所述分支核心单独共价连接的纤维蛋白原结合肽。所述分支核心包含：i)2至10个多官能团氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的多官能团氨基酸残基单独共价连接；il)多个多官能团氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少两个相邻多官能团氨基酸残基中的每一个单独共价连接；Hi)多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少一个多官能团氨基酸残基单独共价连接；iv)多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个多官能团氨基酸残基通过相邻多官能团氨基酸残基的侧链共价连接；或y)单个多官能团氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肽与所述多官能团氨基酸残基的每个官能团单独共价连接。所述多官能团氨基酸残基包含三或四官能团氨基酸残基，或三和四官能团氨基酸残基，或所述单个多官能团氨基酸残基为三或四官能团氨基酸残基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及包含纤维蛋白原结合肽的肽类树状聚合物和试剂，包含所述肽类树状聚合物或试剂的组合物，以及它们用于使纤维蛋白原聚合和用作止血剂的用途。由其可溶性前体纤维蛋白原形成不溶性纤维蛋白聚合物是血液凝结的最后阶段。纤维蛋白原向纤维蛋白的转化分三步进行：纤维蛋白原受凝血酶限制性蛋白水解为纤维蛋白单体；纤维蛋白单体组装成半交错、双链原纤丝；及经组装的纤维蛋白交联以加固凝块。纤维蛋白原分子由三对通过二硫键连接在一起的不同多肽链Aα、Bβ和γ组成。纤维蛋白原链折叠成三个不同的结构区，两个远侧D区与一个中心E区连接。每个D区均含有分别位于γ和Bβ链的C端的聚合‘a’和‘b’孔洞。凝血酶催化短肽，纤维蛋白肽A(FpA)和B(FpB)从中心E区中纤维蛋白原的Aα和Bβ链的氨基端去除，分别暴露出两个聚合位点：具有氨基端序列Gly-Pro-Arg-的“把手(knob)A”；和具有氨基端序列Gly-His-Arg-的“把手B”。一个纤维蛋白单体新暴露的聚合把手通过‘A-a’和‘B-b’把手-孔洞相互作用与另一纤维蛋白单体的相应孔洞相互作用，导致纤维蛋白单体组装成半交错、双链原纤丝。原纤丝侧向聚集以产生较粗纤维，其聚结形成纤维蛋白凝块的三维网络。FpA从纤维蛋白原裂解比FpB更迅速。FpA的去除引发原纤丝的形成，而FpB的去除与其侧向聚集相吻合。FpB释放，在反应开始时非常缓慢，在聚合物形成后加速。FpB裂解上的这种延迟对于正常纤维蛋白组装而言是必需的，并且与不同类型的凝块的形成也有关。其中仅去除了FpA的纤维蛋白I不太紧凑并且更易于被纤溶酶消化，而其中去除了FpA和FpB两者的纤维蛋白II更紧凑并且对纤维蛋白溶解的抵抗力更强。用仅去除FpA或主要去除FpB的蛇毒酶进行的研究已经证明可通过‘A-a’或‘B-b’相互作用形成纤维蛋白凝块，表明两种相互作用均可介导原纤丝形成。用变体重组纤维蛋白原进行的实验显示，当‘A-a’相互作用削弱时‘B-b’相互作用可在原纤丝形成中起重要作用。其它研究已经证实即使当‘B’把手和‘b’孔洞两者都可用时在纤维蛋白片段与纤维蛋白原分子结合期间也仅发生‘A-a’相互作用，并且在排除‘A-a’相互作用时‘B-b’把手-孔洞相互作用明显。然而，肽抑制研究已经表明‘B-b’相互作用可与‘A-a’同时发生。纤维蛋白通过纤维蛋白纤维中不同分子的侧链间的共价交联的形成而稳定。在由因子XIIIa催化的转酰胺反应中在特定谷氨酰胺和赖氨酸侧链之间形成肽键。纤维蛋白组织粘着剂(FTA)是给予通过模仿形成纤维蛋白凝块的凝血级联的最后一步形成的产物的名称。可商购的FTA试剂盒迅速产生用于止血、药物递送和作为外科用胶水和组织封闭剂的强、生物可降解的凝胶。纤维蛋白原、因子XIII、凝血酶和钙离子通常经由在储存期间将纤维蛋白原和因子XIII与钙离子和凝血酶分开的注射器装置递送。从注射器排出期间组分的混合导致纤维蛋白原的凝血酶溶解产生纤维蛋白，纤维蛋白自我组装成稍后通过钙离子活化的因子XIII而交联的凝胶。传统FTA的缺点在于其并非呈即用形式提供，所以在向伤口涂敷之前必须混合FTA的组分。这些组分一经混合，就必须在短时间内使用FTA。在使用前不久制备混合物的要求可特别不利，例如，如果在紧急情况下需要该产品。许多FTA利用被牛抗原，尤其是牛因子V污染的牛凝血酶。对这种抗原产生的抗体可与人因子V交叉反应并且导致致命性出血并且，在一些情况下，导致过敏性反应和死亡。已经从供体的混合血浆中分离出人凝血酶，试图将这些风险降到最低，但是具有传播血源性病原体，特别是病毒的可能性。已经开发出重组人凝血酶并且经美国食品和药物管理局(FDA)批准使用。重组人凝血酶具有最低抗原性的优点并且未携带病毒传播的风险。然而，重组人凝血酶使用经基因修饰的中国仓鼠卵巢细胞系制备，所以生产相对昂贵。纯化的牛和重组人凝血酶制剂呈粉末储存在室温下，使用之前必须用盐水复水成溶液。FDA批准的纯化人凝血酶呈溶液包装，但是这仅可储存在室温下24小时；长期储存需要冷冻(Lew和Weaver，Biologics:Targets&Therapy 2008:2(4)593-599)。使用凝血酶的另一缺点是，酶需要时间来将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，所以在血液凝固加速之前存在延迟。传统FTA也使用很大量的纤维蛋白原。其它止血剂依赖于患者自身的纤维蛋白原促进凝块形成。称为“FLOSEAL”的止血基质由牛源性明胶基质、人源性凝血酶和氯化钙的混合物组成。凝血酶呈冻干形式提供，并且在使用之前必须溶于氯化钙溶液中，再与明胶基质混合。该产品必须在制备8小时内使用。同样在使用前不久制备混合物的要求可特别不利，例如，如果在紧急情况下需要该产品。WO 2008/065388描述了使用能够使纤维蛋白原在凝血酶缺乏时聚合的试剂形成生物凝胶。所述试剂包含使用交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)与可溶性人血清白蛋白(HSA)载体偶联的几种纤维蛋白原结合肽。US 2012/0114682描述了纤维蛋白把手肽的偶联物形成纤维蛋白聚合物的用途，及其在伤口修复上的用途。本文件还描述了包含与聚乙二醇(PEG)连接的纤维蛋白原结合肽GPRP(SEQ ID NO:1)的偶联物的生成。通过使马来酰亚胺活化的PEG与合成把手肽的C端半胱氨酸反应生成“把手-PEG”偶联物。偶联方法往往很复杂，需要多个步骤，其中一些可能需要在不同地点完成，并且往往产生相对低产率的所需产物。偶联产物的另一缺点是，由于其合成中所用的载体和/或连接材料，其可能对灭菌辐射敏感。因此，需要提供可使纤维蛋白原迅速聚合，可以容易地生产而无需使用免疫原性试剂，抗灭菌辐射并且可以呈即用形式提供的止血剂。根据本专利技术的第一个方面，提供了一种肽类树状聚合物，其包含分支核心和多个与所述分支核心单独共价连接的纤维蛋白原结合肽，其中所述分支核心包含：2至10个多官能团氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的多官能团氨基酸残基单独共价连接；多个多官能团氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少两个相邻多官能团氨基酸残基中的每一个单独共价连接；多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少一个多官能团氨基酸残基单独共价连接；多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个多官能团氨基酸残基通过相邻多官能团氨基酸残基的侧链共价连接；或单个多官能团氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肽与所述多官能团氨基酸残基的每个官能团单独共价连接；其中所述多官能团氨基酸残基包含三或四官能团氨基酸残基，或三和四官能团氨基酸残基，或所述单个多官能团氨基酸残基为三或四官能团氨基酸残基。每个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心具有不同的连接点，所以本文将纤维蛋白原结合肽称为与分支核心“单独共价连接”。分支核心包含任何适合的氨基酸序列。分支核心可包含多达10个多官能团氨基酸残基，例如2至10个，或2至6个多官能团氨基酸残基。分支核心可包含多个连续的多官能团氨基酸残基。分支核心可包含多达10个连续的多官能团氨基酸残基。本文所用术语“三官能团氨基酸”指具有为胺(-NH2)的第一官能团、为羧酸(-COOH)的第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肽类树状聚合物，其包含分支核心和多个与所述分支核心单独共价连接的纤维蛋白原结合肽，其中所述分支核心包含：2至10个多官能团氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的多官能团氨基酸残基单独共价连接；多个多官能团氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少两个相邻多官能团氨基酸残基中的每一个单独共价连接；多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少一个多官能团氨基酸残基单独共价连接；多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个多官能团氨基酸残基通过相邻多官能团氨基酸残基的侧链共价连接；或单个多官能团氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肽与所述多官能团氨基酸残基的每个官能团单独共价连接；其中所述多官能团氨基酸残基包含三或四官能团氨基酸残基，或三和四官能团氨基酸残基，或所述单个多官能团氨基酸残基为三或四官能团氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.08 GB 1400292.71.一种肽类树状聚合物，其包含分支核心和多个与所述分支核心单独共价连接的纤维蛋白原结合肽，其中所述分支核心包含：2至10个多官能团氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的多官能团氨基酸残基单独共价连接；多个多官能团氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少两个相邻多官能团氨基酸残基中的每一个单独共价连接；多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少一个多官能团氨基酸残基单独共价连接；多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个多官能团氨基酸残基通过相邻多官能团氨基酸残基的侧链共价连接；或单个多官能团氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肽与所述多官能团氨基酸残基的每个官能团单独共价连接；其中所述多官能团氨基酸残基包含三或四官能团氨基酸残基，或三和四官能团氨基酸残基，或所述单个多官能团氨基酸残基为三或四官能团氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的肽类树状聚合物，其中所述分支核心包含多个连续的多官能团氨基酸残基。3.根据权利要求1或2所述的肽类树状聚合物，其中所述分支核心包含多达10个多官能团氨基酸残基。4.根据权利要求2所述的肽类树状聚合物，其中所述多官能团氨基酸残基或所述多个多官能团氨基酸残基包含赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或半胱氨酸残基。5.根据前述任何权利要求所述的肽类树状聚合物，其具有下列通式(I)：其中：FBP为纤维蛋白原结合肽；-(接头)-为任选接头，优选为非肽接头；X为三官能团氨基酸残基，优选为赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或半胱氨酸残基；Y为-FBP或-NH2；Z在Y为-FBP时为-(接头)-FBP，或在Y为-NH2时为-[-Xn-(接头)-FBP]a-(接头)-FBP，或在Y为-FBP时为-[-Xn-(接头)-FBP]a-(接头)-FBP；其中：Xn为三官能团氨基酸残基，优选为赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或半胱氨酸残基；并且a为1-10，优选1-3。6.根据前述任何权利要求所述的肽类树状聚合物，其具有下列通式(II)：其中：FBP为纤维蛋白原结合肽；-(接头)-为任选接头，其优选地包含-NH(CH2)5CO-；Y为-FBP或-NH2；Z：在Y为-FBP时，为-R-(接头)-FBP，或在Y为-NH2时，在Y为-NH2时，在Y为-NH2时，在Y为-FBP时，其中R为-(CH2)4NH-、-(CH2)3NH-或-(CH2)3NHCNHNH。7.根据前述任何权利要求所述的肽类树状聚合物，其具有下列通式(III)：其中：FBP为纤维蛋白原结合肽；-(接头)-为任选接头，其优选地包含-NH(CH2)5CO-；Y为-FBP或-NH2；Z：在Y为-FBP时，为-(CH2)4NH-(接头)-FBP；或在Y为-NH2时，在Y为-NH2时，在Y为-NH2时，在Y为-FBP时，8.根据前述任何权利要求所述的肽类树状聚合物，其中所述纤维蛋白原结合肽优先于纤维蛋白原的孔洞‘b’与纤维蛋白原的孔洞‘a’结合。9.根据权利要求1-7中任一项所述的肽类树状聚合物，其中所述纤维蛋白原结合肽优先于纤维蛋白原的孔洞‘a’与纤维蛋白原的孔洞‘b’结合。10.根据前述任何权利要求所述的肽类树状聚合物，其中每个纤维蛋白原结合肽通过非肽接头与所述分支核心连接。11.根据权利要求10所述的肽类树状聚合物，其中所述接头包含直链接头，优选直链烷基。12.根据权利要求11所述的肽类树状聚合物，其中所述接头包含：-NH(CH2)nCO-，其中n为1-10。13.根据前述任何权利要求所述的肽类树状聚合物，其不包含以下结构：14.根据前述任何权利要求所述的肽类树状聚合物，其包含不同序列的纤维蛋白原结合肽。15.一种包含多个载体的试剂，其中每个载体具有多个连接到所述载体的纤维蛋白原结合肽，并且其中连接到所述载体的所述纤维蛋白原结合肽包含不同序列的纤维蛋白原结合肽。16.根据权利要求15所述的试剂，其中所述多个载体包含第一多个载体和第二多个载体，并且其中连接到所述第一多个载体的所述纤维蛋白原结合肽具有与连接到所述第二多个载体的所述纤维蛋白原结合肽不同的序列。17.根据权利要求15所述的试剂，其中每个载体具有与之连接的不同序列的纤维蛋白原结合肽。18.根据权利要求14所述的肽类树状聚合物，或根据权利要求15-17中任一项所述的试剂，其中不同序列的所述纤维蛋白原结合肽具有优先于纤维蛋白原的孔洞‘b’与孔洞‘a’结合的不同选择性。19.根据权利要求14或18所述的肽类树状聚合物，或根据权利要求15-18中任一项所述的试剂，其中不同序列的所述纤维蛋白原结合肽包含优先于纤维蛋白原的孔洞‘b’与纤维蛋白原的孔洞‘a’结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·兹博兹茵，
申请(专利权)人：哈莫斯塔蒂斯有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB