快速检测DNA聚合酶3′-5′外切活性或错配的方法和试剂盒技术

快速检测DNA聚合酶3'‑5'外切活性或错配的方法和试剂盒。本方法包括：提供一段已知序列的核酸，以及检测引物，其与已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；使已知序列的核酸和检测引物杂交，加入待测DNA聚合酶以及带荧光标记的、与待聚合的脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸进行第一次信号收集；加入无外切活性的Taq DNA聚合酶，并且分别加入带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸，进行第二次信号收集；综合分析第一次信号和第二次信号，判断待测DNA聚合酶是否发生外切或错配。可检测在四种核苷酸单独存在于反应体系时DNA聚合酶3'‑5'外切活性或错配。

Method and Kit for Rapid Detection of 3'-5'-exogenous Activity or Mismatch of DNA Polymerase

Methods and kits for rapid detection of exogenous activity or mismatch of DNA polymerase 3'5'. The method includes: providing a nucleic acid of a known sequence and detecting primers, which complement each other with the nucleic acid of a known sequence and are different from the last deoxynucleotide of the 3'hydroxyl end and the first two deoxynucleotides to be polymerized; hybridizing the nucleic acid of a known sequence with detecting primers, adding DNA polymerase to be tested and fluorescent labeled deoxynucleotides different from those to be polymerized. The first signal collection was carried out by adding Taq DNA polymerase without exogenous activity, and the second signal collection was carried out by adding the first deoxynucleotide with fluorescent labeling and the second deoxynucleotide with fluorescent labeling respectively. The first and second signals were comprehensively analyzed to determine whether the DNA polymerase was exogenous or not. Mismatch. The exogenous activity or mismatch of DNA polymerase 3'5' can be detected when four nucleotides exist alone in the reaction system.

【技术实现步骤摘要】
快速检测DNA聚合酶3′-5′外切活性或错配的方法和试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法和试剂盒。
技术介绍
3'端有自由羟基的dNTP用于测序中可以使测序速度大大提升。新的测序技术如单分子测序等更倾向于使用这种3'-OH的dNTP以实现快速和长读长的目标。但是使用这种dNTP时，很多情况下，需要将四种脱氧核苷酸按照一定的顺序单独加入，每次只加入一种，这就要求所使用的DNA聚合酶在反应体系中只有一种dNTP存在时能够忠实地依次加入正确配对的dNTP，不能有3'-5'外切活性或错配。在实际应用中发现，当四种dNTP同时存在时，无3'-5'外切活性且高保真的DNA聚合酶不表现出3'-5'外切活性或错配；当只有一种dNTP时，若待聚合的脱氧核苷酸位置与加入的dNTP种类相同，则可以正确聚合；若待聚合的脱氧核苷酸位置与加入的dNTP种类不同，有些DNA聚合酶会表现出3'-5'外切活性或错配，即按3'-5'方向切除一个或几个脱氧核苷酸，直至将dNTP加上，或直接加上错配的dNTP。这种DNA聚合酶的特性就会导致测序错误，影响测序的数据质量。因此，急需开发一种快速检测DNA聚合酶在只有一种dNTP存在时，是否能忠实聚合dNTP的方法。现有的对DNA聚合酶3'-5'外切活性的检测技术是放射性同位素法，即合成一条3'末端带3H标记dATP的单链寡核苷酸，3'-5'外切酶活性可将[3H]-dATP切除。通过测定放射性的含量计算3'-5'外切酶活性。放射性同位素法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化。有的研究人员(CN104293930A，一种3'-5'外切酶活性测定方法)将3'端有错配脱氧核苷酸的引物与单链模板混合并退火，加入酶进行3'脱氧核苷酸外切反应，然后加入足量没有3'-5'外切酶活性的聚合酶延长引物直至获得双链DNA，通过检测反应体系中双链DNA的相对量，由该检测结果推导出外切酶活性程度。然而这些方法不能检测DNA聚合酶在单个dNTP存在且与待测位置脱氧核苷酸不匹配时外切活性。其它的3'-5'外切活性检测方法也只限于检测3'端错配时的DNA聚合酶的3'-5'外切活性，都不能检测当3'端配对正确时DNA聚合酶的3'-5'外切活性。因此，不能适用于某些测序酶的外切活性检测和筛选。对DNA聚合酶错配率的传统检测方法(例如蓝白斑实验、质粒内切法实验)操作繁琐，也不能适用于某些特殊需求的测序酶的检测和筛选。
技术实现思路
本专利技术提供一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法和试剂盒，可以通过两步反应，检测在dATP、dCTP、dGTP、dTTP等四种核苷酸单独存在于反应体系时的DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的情况。根据第一方面，一种实施例中提供一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法，包括：提供一段已知序列的核酸，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物，该检测引物与上述已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；提供两个反应体系，使上述已知序列的核酸和上述检测引物在其内杂交，加入待测的DNA聚合酶以及带荧光标记的、与待聚合的脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第一次信号收集；向上述两个反应体系中加入无外切活性的TaqDNA聚合酶，并且分别加入带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第二次信号收集；综合分析上述第一次信号和上述第二次信号，判断上述待测的DNA聚合酶是否发生外切或错配。进一步地，上述检测引物包括四种，分别针对A、C、G、T四种待测脱氧核苷酸。进一步地，上述带荧光标记的脱氧核苷酸的荧光标记、上述第一位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记以及上述第二位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记互不相同。进一步地，上述方法还包括：提供第三个反应体系，使上述已知序列的核酸和上述检测引物在其内杂交，加入上述待测的DNA聚合酶和带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，作为对照组。进一步地，上述已知序列的核酸装载在芯片上，或使用链霉亲和素和生物素固定在磁珠或芯片上，或使用其它方式将上述已知序列的核酸固定在芯片或磁珠上。根据第二方面，一种实施例中提供一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的试剂盒，包括：一段已知序列的核酸，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物，该检测引物与上述已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；与待聚合的脱氧核苷酸不同的带荧光标记的脱氧核苷酸，用于在反应池内与待测的DNA聚合酶、上述已知序列的核酸和上述检测引物一起进行反应以进行第一次信号收集；无外切活性的TaqDNA聚合酶、带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸，用于在反应池内进行反应以进行第二次信号收集。进一步地，上述检测引物包括四种，分别针对A、C、G、T四种待测脱氧核苷酸。进一步地，上述带荧光标记的脱氧核苷酸的荧光标记、上述第一位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记以及上述第二位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记互不相同。进一步地，上述试剂盒还包括：反应池，用于在其内进行反应。进一步地，上述已知序列的核酸装载在芯片上，或使用链霉亲和素和生物素固定在磁珠或芯片上，或使用其它方式将上述已知序列的核酸固定在芯片或磁珠上。本专利技术首次提出了可以检测DNA聚合酶在只有一种dNTP存在的情况时的3'-5'外切活性或错配，为快速测序所需的DNA聚合酶提供筛选方法；该方法使用荧光作为检测信号，避免了放射性污染；对模板底物结构或序列没有特殊要求，可直接用于筛选，易于实现；并且可以直接利用微量96孔或384孔板进行筛选测试实验，并可根据筛选量同时进行多块板实验，且实验结果可直接使用，无需对数据进行额外的处理。附图说明图1为本专利技术实施例中快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法的原理示意图；图2为本专利技术实施例中快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法的流程示意图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本专利技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本专利技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本专利技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。如图1所示，本专利技术一个实施例中，快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法，包括：(1)提供一段固定在固相上的已知序列的核酸(图中②所示)，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物(图中①所示)，该检测引物与已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸(图中①所示的检测引物的3'端A)和待聚合的前两位脱氧核苷酸(图中④和⑤所示)互不相同。在一些具体实施方式中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测DNA聚合酶3'‑5'外切活性或错配的方法，其特征在于，包括：提供一段已知序列的核酸，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物，该检测引物与所述已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；提供两个反应体系，使所述已知序列的核酸和所述检测引物在其内杂交，加入待测的DNA聚合酶以及带荧光标记的、与待聚合的脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第一次信号收集；向所述两个反应体系中加入无外切活性的Taq DNA聚合酶，并且分别加入带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第二次信号收集；综合分析所述第一次信号和所述第二次信号，判断所述待测的DNA聚合酶是否发生外切或错配。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法，其特征在于，包括：提供一段已知序列的核酸，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物，该检测引物与所述已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；提供两个反应体系，使所述已知序列的核酸和所述检测引物在其内杂交，加入待测的DNA聚合酶以及带荧光标记的、与待聚合的脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第一次信号收集；向所述两个反应体系中加入无外切活性的TaqDNA聚合酶，并且分别加入带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第二次信号收集；综合分析所述第一次信号和所述第二次信号，判断所述待测的DNA聚合酶是否发生外切或错配。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测引物包括四种，分别针对A、C、G、T四种待测脱氧核苷酸。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带荧光标记的脱氧核苷酸的荧光标记、所述第一位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记以及所述第二位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记互不相同。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：提供第三个反应体系，使所述已知序列的核酸和所述检测引物在其内杂交，加入所述待测的DNA聚合酶和带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，作为对照组。5.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静静，章文蔚，陈奥，徐崇钧，龚梅花，罗银铃，罗宇芬，李长英，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44