一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及应用，属于生物检测技术领域。所述检测方法包括：先将待测样本预处理成含有目标DNA的溶液，再往溶液中加入对应的三个发夹探针H1、H2、H3，目标DNA识别并打开H1，单向或双向引发H1和H2发生杂交链式反应，H2打开后其环序列引发打开H3形成多支杂交链式产物，通过打开的H3与界面的探针杂交将多支杂交链式产物多价捕获在界面，分析界面上的信号标记实现目标DNA的定量检测。本发明专利技术提供的检测方法中杂交链式反应在溶液中进行，显著提高杂交效率，再通过多价捕获的方式高效地将反应产物捕获到界面上，实现超灵敏核酸检测；设计的信号探针具有通用性，极大节约检测成本。

A Nucleic Acid Detection Method Based on Multi-Branch Hybrid Chain Reaction and Its Application

The invention discloses a nucleic acid detection method based on multi-branch hybridization chain reaction and its application, which belongs to the technical field of biological detection. The detection method includes: firstly, the sample is pretreated into a solution containing target DNA, and then three corresponding hairpin probes H1, H2 and H3 are added to the solution. Target DNA identifies and opens H1. One-way or two-way initiation of the hybridization chain reaction between H1 and H2 occurs. When H2 is opened, its loop sequence triggers the opening of H3 to form a multi-branch hybridization chain product. Through the opening of H3 and the interfacial probe hybridization, more hybridization will occur. Branch hybridization chain products are captured at the interface, and signal markers on the interface are analyzed to achieve quantitative detection of target DNA. In the detection method provided by the invention, the hybridization chain reaction is carried out in solution, which significantly improves the hybridization efficiency, and then the reaction products are efficiently captured on the interface by means of multivalent capture to realize ultra-sensitive nucleic acid detection; the designed signal probe has universality and greatly saves the detection cost.

【技术实现步骤摘要】
一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及应用
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及其用于液体活检中药物/生物小分子、DNA、RNA、抗原/抗体、酶、外泌体和细胞中的精准分析检测。
技术介绍
精准医学分析中的液体活检是当前热门的检测技术之一，血清、血浆或血液中特定DNA，RNA，药物/生物小分子，蛋白，外泌体以及细胞含量的变化，可用于早期疾病筛查与诊断、疾病术后复发判断以及药代水平监测。当前基因测序已成功应用于癌症早期筛查，通过检测基因突变预判人群患癌症的几率，该方法具有较高的准确率，然而该技术当前的检测成本仍较高，不利于广泛推广使用，因此迫切需要简便、低成本、高准确性的传感器研制。随着DNA纳米技术的不断发展，涌现出了各种DNA纳米结构材料用于检测人体外周血中的疾病相关DNA，RNA等，由于人体外周血中的靶标分子含量普遍较低，当前研制的传感器常用滚环放大法(Rollingcircleamplification,RCA)(LizardiP.M.,HuangX.X.,ZhuZ.R.,WardP.B.,ThomasD.C.,WardD.C.,Nat.Genetics.,1998,19,225-232.)和杂交链式反应(Hybridizationchainreaction,HCR)(DirksR.M.,PierceN.A.,P.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2004,101,15275-15278.)用于放大输出检测信号，检测各种生物靶标分子。HCR相比RCA不需要额外加入聚合酶，且在室温下就能发生反应，产物是具有重复单元的双链长链结构。申请公布号为CN106093438A的专利文献公开了一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，在聚乙烯微孔上，将VEGF与适配体和抗体形成抗体-蛋白-适配体的夹心结构，在适配体的末端包含有一段18碱基的延长序列，然后利用合成的两端蔗糖转移酶标记的辅助探针，这两端酶标探针以18碱基的延长序列为模板，引发链杂交扩增反应，从而在微孔上固定大量的蔗糖转移酶，这些酶催化蔗糖转化为葡萄糖，利用血糖仪指示产生的葡萄糖浓度，进而测出待分析目标物中血管内皮生长因子的含量。杂交链式反应已被广泛应用于各类生物靶标分子的检测，当前存在的主要瓶颈缺陷有以下几点：a.HCR在溶液环境中对比在界面的杂交效率更高，然而溶液中常用的信号输出方法如荧光、显色、化学发光等，其信号输出灵敏度相对界面技术较差；信号输出灵敏度相对更高的电化学、界面荧光增强、拉曼光谱和表面等离子共振等技术，又需要HCR在界面进行，降低了HCR的杂交效率。b.HCR中使用的发卡探针不能通用，随着检测对象的改变而改变。c.HCR中使用的发卡探针稳定性随着检测对象的改变而改变，发卡结构稳定性较差时，容易自身引发杂交链式反应，降低检测过程中的信噪比。d.界面引发杂交链式反应的传感器一般灵敏度更高，但通常需要多步骤进行靶标检测。e.不能调控靶标的有效检测浓度范围。当前发展出的利用杂交链式反应结合酶催化的方法可以实现DNA和RNA几百个甚至几十个拷贝的检测灵敏度，然而这些方法均较为繁琐，需要多步骤处理实现靶标分子的检测，使这些方法局限于实验室的理想检测环境，难以应用于临床检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法，利用三条发卡探针对目标DNA进行单向或双向杂交链式反应，形成多支杂交链式反应产物，再利用界面捕获，信号放大输出，进而实现靶标分子的检测，以解决传统杂交链式反应在靶标分析中的部分缺陷，如检测灵敏度低、杂交效率差、实验步骤繁琐、检测探针不能通用、动态检测范围不可控等。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法，包括以下步骤：(1)将待测样本预处理得到含有目标DNA的溶液，所述目标DNA包含a序列；(2)合成发夹探针：根据目标DNA序列设计发夹探针H1、H2、H3，H1包括H1b、H1a’、H1c三个部分，其中H1b的部分序列与H1c的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2包括H2b’、H2d、H2c’三个部分，其中H2b’的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2b’与H1b互补，H2c’与H1c互补；H3包括H3e、H3f、H3e’、H3g四个部分，其中H3e与H3e’互补成双链作为H3发夹结构的茎部，H3f形成发夹结构的环部，H3g为H3的3’端单链粘性末端，H3e’和H3g与H2d互补；或者H1包括A和B两个部分，其中A的部分序列与B的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，A为a序列的互补序列；H2包括A’、H2d和B’三个部分，其中A’的部分序列与B’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，A’与A互补，B’与B互补；H3的设计同上；所述H2或H3上修饰有信号标记；(3)基于多支杂交链式反应进行核酸检测：往含有目标DNA的溶液中加入H1、H2、H3，混合，室温下反应，形成多支杂交链反应产物，再将金界面上自组装有DNA探针的载体置于反应溶液中，所述DNA探针具有与H3中的H3f及H3e的部分序列互补配对的序列，DNA探针与H3杂交将多支杂交链反应产物捕获到金界面上；然后分析金界面上的信号标记变化测定溶液中目标DNA的含量，进而计算出待测样本中目标物的含量。本专利技术检测方法的原理如下：在目标DNA存在下，可以识别打开发卡H1(根据设计可以将H1环部分碱基或粘性末端方向的碱基作为靶标特异性识别位点)，从而双向或单向引发杂交链式反应，H2被打开后，环部位碱基变为单直链，可以继续打开H3，使杂交链式直链产物变为多支长链产物，通过多支单链与任意界面组装的探针杂交，可以高效的将HCR产物多价捕获于界面。在各发卡探针上修饰荧光信号标记或电化学信号标记，界面的信号增量与靶标的浓度正相关，根据荧光强度或电化学信号判断核酸浓度。通过构建标准检测曲线，实现未知样品靶标浓度检测。由于杂交链式反应是在溶液体系中进行，使得杂交效率显著提升，再通过多价捕获方式高效地将杂交反应产物捕获到界面上，通过分析信号标记变化实现超灵敏核酸检测。针对发夹探针的设计，本专利技术提供了两种方案，方案一：在传统发夹结构H1的中间位置插入与目标DNA互补的序列，在传统发夹结构H2的中间位置插入目标DNA互补链以外的一段碱基序列，该段碱基序列与H3互补。具体地：H1包括H1b、H1a’、H1c三个部分，H1a’为a序列的互补序列，H1b和H1c并非完全互补配对，H1b包括b1和b2，H1c包括c1和c2，b2与c2互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’和c1作为发夹结构的环部，b2的长度小于H1a’；H2包括H2b’、H2d、H2c’三个部分，H2b’包括b2’和b1’，H2c’包括c2’和c1’，b2’与c2’互补成双链作为H2发夹结构的茎部，b1’和H2d作为发夹结构的环部，H2b’与H1b互补，H2c’与H1c互补；H3包括H3e、H3f、H3e’、H3g四个部分，H3e’和H3g与H2d互补。目标DNA与H1的环序列中的H1a’互补，打开H1后暴露出茎部的H1b、H1c，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测样本预处理得到含有目标DNA的溶液，所述目标DNA包含a序列；(2)合成发夹探针：根据目标DNA序列设计发夹探针H1、H2、H3，H1包括H1b、H1a’、H1c三个部分，其中H1b的部分序列与H1c的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2包括H2b’、H2d、H2c’三个部分，其中H2b’的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2b’与H1b互补，H2c’与H1c互补；H3包括H3e、H3f、H3e’、H3g四个部分，其中H3e与H3e’互补成双链作为H3发夹结构的茎部，H3f形成发夹结构的环部，H3g为H3的3’端单链粘性末端，H3e’和H3g与H2d互补；或者H1包括A和B两个部分，其中A的部分序列与B的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，A为a序列的互补序列；H2包括A’、H2d和B’三个部分，其中A’的部分序列与B’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，A’与A互补，B’与B互补；H3的设计同上；所述H2或H3上修饰有信号标记；(3)基于多支杂交链式反应进行核酸检测：往含有目标DNA的溶液中加入H1、H2、H3，混合，室温下反应，形成多支杂交链反应产物，再将金界面上自组装有DNA探针的载体置于反应溶液中，所述DNA探针具有与H3中的H3f及H3e的部分序列互补配对的序列，DNA探针与H3杂交将多支杂交链反应产物捕获到金界面上；然后分析金界面上的信号标记变化测定溶液中目标DNA的含量，进而计算出待测样本中目标物的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测样本预处理得到含有目标DNA的溶液，所述目标DNA包含a序列；(2)合成发夹探针：根据目标DNA序列设计发夹探针H1、H2、H3，H1包括H1b、H1a’、H1c三个部分，其中H1b的部分序列与H1c的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’为a序列的互补序列；H2包括H2b’、H2d、H2c’三个部分，其中H2b’的部分序列和H2c’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H2b’与H1b互补，H2c’与H1c互补；H3包括H3e、H3f、H3e’、H3g四个部分，其中H3e与H3e’互补成双链作为H3发夹结构的茎部，H3f形成发夹结构的环部，H3g为H3的3’端单链粘性末端，H3e’和H3g与H2d互补；或者H1包括A和B两个部分，其中A的部分序列与B的部分序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，A为a序列的互补序列；H2包括A’、H2d和B’三个部分，其中A’的部分序列与B’的部分序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，A’与A互补，B’与B互补；H3的设计同上；所述H2或H3上修饰有信号标记；(3)基于多支杂交链式反应进行核酸检测：往含有目标DNA的溶液中加入H1、H2、H3，混合，室温下反应，形成多支杂交链反应产物，再将金界面上自组装有DNA探针的载体置于反应溶液中，所述DNA探针具有与H3中的H3f及H3e的部分序列互补配对的序列，DNA探针与H3杂交将多支杂交链反应产物捕获到金界面上；然后分析金界面上的信号标记变化测定溶液中目标DNA的含量，进而计算出待测样本中目标物的含量。2.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述的待测样本为DNA、RNA、药物/生物小分子、抗原/抗体、酶、外泌体或肿瘤细胞。3.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的含有目标DNA的溶液的缓冲体系为SPSC溶液。4.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤(2)中，H1b、H1a’、H2d序列长度均为18-28bp。5.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述的信号标记为生物素或荧光基团。6.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：周国宝，李蕾，卢星，
申请(专利权)人：嘉兴学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33