本发明专利技术公开了一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，步骤：1、解旋酶蛋白的表达与纯化：人工合成乙型脑炎病毒NS3基因，用NcoI和XhoI分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体过夜连接，得一种解旋酶蛋白，其序列为SEQIDNO.1所示，收集表达蛋白的上清，用Ni2+亲和层析法纯化解旋酶蛋白，用BCA法测定蛋白浓度；2、解旋酶DNA底物的设计；3、在黑色96孔中加入解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液，混合孵育，在荧光检测仪中检测体系中的荧光强度，不加入底物的对照组；4、计算化合物抑制率。方法简单易行，灵敏度高，成本低，样品少，对解旋酶反应的过程进行监测，对今后的乙型脑炎病毒药物的开发具有极大意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及，可用于药物的筛选。
技术介绍
乙型脑炎病毒不仅引起人的中枢神经系统疾病，还可引起猪的繁殖障碍性疾病，是一种重要的人畜共患传染病病原。乙型脑炎病毒主要侵入神经系统，包括丘脑，基底神经节，脑干，小脑，大脑皮层和脊髓，导致严重的中枢神经系统疾病，例如脊髓灰质炎样严重瘫痪，无菌性脑膜炎和脑炎，71%的患者都是基底神经节和丘脑损伤，严重出现运动障碍，43%患者脑干损伤，经常出现急性呼吸衰竭症状，甚至死亡。患者的病死率与临床症状高达 10% 50%，而且大约一半乙型脑炎病毒感染幸存者都有严重的神经后遗症。在亚洲每年大约50，000乙脑病例中就有15，000例死亡。2006年7月山西发生日本乙型脑炎流行，共60多人发病，其中19人死亡，造成了较大的社会影响。目前已研制出乙型脑炎病毒的弱毒疫苗和灭活疫苗，具有较好的免疫效果，但仍有免疫失败的报道。同时，日本乙型脑炎发病后在脑中复制，给病人造成不可逆的智力损伤，如果能使用药物对该病起到一定的早期预防和治疗效果，则对于该病的治疗手段的研究具有重大意义。而目前仍未有关于乙型脑炎病毒药物及其筛选方法的报道。乙型脑炎病毒病毒NS3的C端440个氨基酸为解旋酶和NTP酶，它可以利用水解ATP释放的能量，将病毒在复制过程中形成的RNA双链解旋。解旋酶是乙型脑炎病毒的复制所必需，该酶失去活性后病毒增殖停止，因此成为良好的抗病毒靶标。根据解旋酶的酶活性特征，具有多种靶向药物筛选与设计的策略，如a.阻止ATP的结合；b.阻止RNA底物的结合；c.阻止解旋酶的空间变构。Borowski P等(2002)合成了一种环扩大核苷(ring-expanded nucleoside),对于西尼罗病毒解旋酶具有一定的抑制活性(IC50=25-30uM)。Kaczor A等(2010)根据日本乙型脑炎病毒的解旋酶结构，建立了一个基于酶结构的药效团模型，用该模型对116万个化合物进行了虚拟筛选，发现了 15个化合物具有较好的结合活性，并且预测了其可以通过血脑屏障，但未进行酶抑制活性的试验研究。但是，到目前为止针对乙型脑炎病毒解旋酶的药物设计模型仍然没有建立，也未见针对乙型脑炎病毒解旋酶的药物报道。本专利技术建立了一种针对乙型脑炎病毒解旋酶的药物筛选模型，应用该模型可在蛋白水平进行高通量、低成本的进行乙型脑炎抗病毒药物筛选，为乙型脑炎病毒的药物发现提供了一种手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了，方法简单，易于操作。解旋酶是乙型脑炎病毒基因组编码的一种功能蛋白，该蛋白负责将病毒复制过程中形成的基因组RNA双链解旋，解旋后的正链RNA参与子代病毒的包装过程，如果抑制解旋酶的活性，乙型脑炎病毒的增殖也将受到抑制。本专利技术是基于解旋酶活性的机制，采用荧光共振能量转移的方法，在两条底物DNA的两端分别标记荧光和淬灭基团，当两条底物形成双链后，荧光基团的能量被淬灭基团吸收，因此体系中不发出荧光。当解旋酶将双链解开后，两个基团在空间上距离变大，荧光基团则发出荧光，荧光强度越高则说明酶活性越高。基于该酶活性的评价体系，进一步建立了抑制剂筛选方法，并进行了初步应用。为了达到上述目的，本专利技术采取如下技术措施，其制备步骤如下(I)解旋酶蛋白的表达与纯化人工合成乙型脑炎病毒NS3基因(Genbank登录号U47032)，用Nco I和Xho I分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体pET30a， T4 DNALigase (TakaRa,大连宝生物工程有限公司)16 °C过夜连接，得到重组质粒 pET30a_helicase,构建好的重组质粒pET30a_helicase转化到大肠杆菌BL21 (DE3)plysS 中进行表达，得到一种解旋酶蛋白，其序列为SEQ ID NO.1所示。收集表达蛋白上清用Ni2+ 亲和纯化，纯化的解旋酶蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定后加甘油至终浓度20%(v/ V)，用BCA法测定浓度，_80°C冻存备用。用大肠杆菌大量表达解旋酶蛋白，在表达蛋白上带有6 X His标签，收集表达蛋白的上清，用Ni2+亲和层析法纯化解旋酶蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。(2)解旋酶DNA底物的设计人工合成3条DNA链，分别命名为F、Q、C，序列分别为F: (Cy5-)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTT ；Q:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA-(BHQ2)；C:TAGTACCGCCACCCTCAGAACC。 其中F和Q、C和Q互补，F带有一段polyT的末端突出，以利于解旋酶的结合并起始反应。(3)在黑色96孔或384孔板中加入解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液 (溶解蛋白的缓冲液，即20mM的Tris-base，150mM的Nacl，5%的甘油)，混合孵育5分钟后， 加入F链200nM与Q链240nM，再孵育5分钟，加入C链2. 4uM、15mM Mg2VlOmM的Mn2+和ATP 2mM，置37°C反应90分钟后，在荧光检测仪(TECAN infinite F200多功能酶标仪)中检测体系中的荧光强度。同时设置不加入待筛化合物的对照组(C组)以及不加入底物的对照组 (Cl 组)。(4)计算化合物抑制率抑制率=1-(实验组荧光平均值-Cl组荧光平均值)+ (C 组荧光平均值-Cl组荧光平均值)。选择抑制率最高的化合物进行抗病毒的研究。专利技术人对40种化合物进行了蛋白水平上的筛选，共初步筛得四种能够抑制解旋酶活性的化合物。其分别为2--4-{4-硝基苯基}-N-苯基_1，3_噻唑_5_甲酰胺；4-( {4-硝基-1H-吡唑-1-基}甲基)-N_ 苯甲酰胺；3- _2，4_ 二氧代_1，3_噻唑烷_5_亚基}甲基)-2_呋喃基]苯甲酸；N-硫代甲酰基}氨基)-1, 3-苯并噻唑_2_基]丁酰胺；对解旋活性的抑制率分别为30. 52%、56. 29%、39. 83%、55. 63%。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点1.传统解旋酶的检测，主要采用放射性同位素标记，该技术需要放射性防护，产生很多放射性废物，对实验室要求比较高。而且，标记的探针只能使用两周左右，因此该技术已渐渐被淘汰。本专利技术纯化出的可溶性的活性高的解旋酶蛋白，并在蛋白水平上利用荧光共振能量转移的方法，对最佳酶浓度、最佳底物浓度、最佳二价金属离子浓度、最佳捕获链浓度、最佳ATP浓度、最佳反应反应温度进行了试验，确定了酶活检测的最佳反应体系，该方法简单易行，在普通实验条件即可进行，灵敏度高，成本相对较低，所需样品少，而且可以 对解旋酶反应的过程进行监测。2.本专利技术中建立的解旋酶抑制剂筛选方法，在细胞外进行，不受细胞状态及细胞中杂蛋白的影响，反应稳定、重复性好，避免了化合物或DMSO对细胞的毒性而造成的试验误差。3.本专利技术中建立的解旋酶抑制剂筛选方法，使用的解旋酶蛋白为原核表达的可溶性蛋白，使用的底物为合成的短DNA链，筛选的成本非常低廉，同时该筛选体系可在96孔板甚至384孔板中进行微量操作，进一步降低了筛选的成本，可轻易完成高通量的操作。附图说明图1为一种纯化的解旋酶蛋白SDS-PAGE效果示意图经Ni2+亲和纯化后，得到了较高纯度的蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，其制备步骤如下：（1）解旋酶蛋白的表达与纯化：人工合成乙型脑炎病毒NS3基因，用Nco?I和Xho?I分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体pET30a，T4?DNA?Ligase?16℃过夜连接，得到重组质粒pET30a?helicase，构建好的重组质粒pET30a?helicase转化到大肠杆菌BL21（DE3）plysS中进行表达，得到一种解旋酶蛋白，其序列为SEQ?ID?NO.1所示，收集表达蛋白上清用Ni2+亲和纯化，纯化的解旋酶蛋白经SDS?PAGE及Western?blot鉴定后加甘油至终浓度20%?v/v，用BCA法测定浓度，?80℃冻存备用；用大肠杆菌大量表达解旋酶蛋白，在表达蛋白上带有6×His标签，收集表达蛋白的上清，用Ni2+亲和层析法纯化解旋酶蛋白，用BCA法测定蛋白浓度；（2）解旋酶DNA底物的设计：人工合成3条DNA链，分别命名为F、Q、C，序列分别为：F:?(Cy5?)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTT；Q:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA?(BHQ2)；C:TAGTACCGCCACCCTCAGAACC；（3）在黑色96孔或384孔板中加入解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液，混合孵育5分钟后，加入F链200nM与Q链240nM，再孵育5分钟，加入C链2.4uM、15mM?Mg2+/10mM的Mn2+和ATP?2mM，置37℃反应90分钟后，在荧光检测仪中检测体系中的荧光强度，同时设置不加入待筛化合物的对照组以及不加入底物的对照组；（4）计算化合物抑制率：抑制率=1?（实验组荧光平均值?C1组荧光平均值）÷（C组荧光平均值?C1组荧光平均值），选择抑制率最高的化合物进行抗病毒的研究。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋云峰，方金娥，曹胜波，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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