一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，步骤：1、解旋酶蛋白的表达与纯化：人工合成乙型脑炎病毒NS3基因，用NcoI和XhoI分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体过夜连接，得一种解旋酶蛋白，其序列为SEQIDNO.1所示，收集表达蛋白的上清，用Ni2+亲和层析法纯化解旋酶蛋白，用BCA法测定蛋白浓度；2、解旋酶DNA底物的设计；3、在黑色96孔中加入解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液，混合孵育，在荧光检测仪中检测体系中的荧光强度，不加入底物的对照组；4、计算化合物抑制率。方法简单易行，灵敏度高，成本低，样品少，对解旋酶反应的过程进行监测，对今后的乙型脑炎病毒药物的开发具有极大意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，具体涉及，可用于药物的筛选。
技术介绍
乙型脑炎病毒不仅引起人的中枢神经系统疾病，还可引起猪的繁殖障碍性疾病，是一种重要的人畜共患传染病病原。乙型脑炎病毒主要侵入神经系统，包括丘脑，基底神经节，脑干，小脑，大脑皮层和脊髓，导致严重的中枢神经系统疾病，例如脊髓灰质炎样严重瘫痪，无菌性脑膜炎和脑炎，71%的患者都是基底神经节和丘脑损伤，严重出现运动障碍，43%患者脑干损伤，经常出现急性呼吸衰竭症状，甚至死亡。患者的病死率与临床症状高达 10% 50%，而且大约一半乙型脑炎病毒感染幸存者都有严重的神经后遗症。在亚洲每年大约50，000乙脑病例中就有15，000例死亡。2006年7月山西发生日本乙型脑炎流行，共60多人发病，其中19人死亡，造成了较大的社会影响。目前已研制出乙型脑炎病毒的弱毒疫苗和灭活疫苗，具有较好的免疫效果，但仍有免疫失败的报道。同时，日本乙型脑炎发病后在脑中复制，给病人造成不可逆的智力损伤，如果能使用药物对该病起到一定的早期预防和治疗效果，则对于该病的治疗手段的研究具有重大意义。而目前仍未有关于乙型脑炎病毒药物及其筛选方法的报道。乙型脑炎本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，其制备步骤如下：（1）解旋酶蛋白的表达与纯化：人工合成乙型脑炎病毒NS3基因，用Nco?I和Xho?I分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体pET30a，T4?DNA?Ligase?16℃过夜连接，得到重组质粒pET30a?helicase，构建好的重组质粒pET30a?helicase转化到大肠杆菌BL21（DE3）plysS中进行表达，得到一种解旋酶蛋白，其序列为SEQ?ID?NO.1所示，收集表达蛋白上清用Ni2+亲和纯化，纯化的解旋酶蛋白经SDS?PAGE及Western?blot鉴定后加甘油至终浓度20%?v/v，用BCA...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋云峰，方金娥，曹胜波，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：