基于已知E1查找特异性介导靶蛋白泛素反应E2-E3的方法技术

本发明专利技术涉及生物化学与分子生物学领域。具体而言，特指一种从人体细胞众多E3中查找出特异性识别靶蛋白泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化反应的E2/E3系统的方法。该方法是先建立体外泛素化分析系统，通过已知的泛素活化酶E1和以HelaS100馏分作为E3源，筛选出介导靶蛋白泛素反应的结合酶E2；再采用多重层析柱组合，结合质谱分析，从人体细胞中查找特异性识别靶蛋白的泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化修饰的E2/E3系统。通过这种方法，可以方便、准确地查找出识别靶蛋白的底物识别因子－泛素连接酶E3；建立介导靶蛋白泛素化修饰的E2/E3调控系统。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化学与分子生物学领域。具体而言，特指一种从人体细胞众多E3中查找出特异性识别靶蛋白泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化反应的E2/E3系统的方法。
技术介绍
在各种形式的蛋白质翻译后修饰过程中，泛素化修饰近年来引起了越来越广泛的关注。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它通过调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况，在细胞生命活动的许多进程中发挥着至关重要的作用。被多聚泛素化修饰(Poly-ubiquitination)的革巴蛋白一般会被蛋白酶体识别进而被降解，此过程主要涉及三种关键的酶活化酶E1，结合酶E2和连接酶E3。蛋白质被泛 素化修饰的作用机制为首先由El在ATP能量作用下通过其活性中心的Cys残基与泛素的C端形成硫酯键活化单个游离的泛素，然后El将活化的泛素递交给E2，最后由E3募集特异的底物和E2，并介导泛素从E2转移到靶蛋白。由于蛋白酶体识别泛素化的蛋白并将其降解是一个非特异性的进程，因此，E3在整个蛋白质的降解过程中发挥了至关重要的作用，它决定了反应的特异性。人类蛋白质组中含有两种El酶、50多种E2酶、600多种E3酶(Bhoj，V. G. & Chen, Z. J. , Nature, 2009，458:430-437)。E3 酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶(Zheng，N., Structure,2003，11: 5-6)和其它含有RING结构域或类似RING结构域的E3酶(Petroski, M. D.，et al. , Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6: 9-20)。几乎所有主要的DNA修复途径、损伤避免机制和细胞周期检查点响应等过程都或多或少地受到泛素化和(或)类泛素化修饰SUMO修饰途径的调控。泛素化和SUMO参与多种DNA的修复过程,如跨损伤修复(Translesion synthesis),核苷酸切除修复(Nucleotideexcision),同源重组(Homologous recombination)等。作为一种最主要的聚合酶,DNA聚合酶δ (Pol δ )在各种形DNA修复过程中通过重新合成DNA (Re-synthesis of DNA)和缺口填补(Gap-filling)起着重要的作用(Branzei, D. &. Foiani, M. , Nat Rev MolCell Biol, 2008, 9: 297-308)。通过对人Pol δ进一步的研究发现，Pol δ本身也是一个 DNA 损伤响应的靶目标(Zhang, S·，et al., J Biol Chem, 2007，282: 15330-40)。在体外培养的人细胞中，通过遗传毒物处理或射线诱导而引起DNA损伤的情况下，Pol δ的小亚基ρ12在ATR/Chkl通路调控下以泛素化依赖的形式降解，从而导致细胞内Pol δ由原来的四聚体形式Pol δ 4转换为三聚体Pol δ 3以应对DNA损伤(Meng，X.，et al.,Nucleic Acids Res, 2009，37: 647-657)。类似的研究也表明，pl2 和 Pol δ 的另外一个调节亚基ρ68也能被泛素化和SUMO修饰(Liu, G. &. Warbrick, E. , Biochem BiophysRes Commun, 2006, 349: 360-6),但到目前为止,对pl2被降解(下调)的泛素修饰机制不清楚，其关键点在于，还没有建立一个很好的方法从众多的E3中确定出特异性识别和介导靶蛋白进行泛素化修饰的连接酶E3，寻找E2/E3系统调控靶蛋白的泛素化修饰途径成为一项令人“恐怖”的实验。癌症是一种由遗传和表观遗传改变，以细胞异常增殖及转移为特点的一大类疾病，而泛素修饰系统则由一系列能催化细胞内靶蛋白泛素化的酶和底物蛋白所组成，对细胞内的多种功能进行调控，如果泛素修饰系统出现问题将引起人体内的多种病理改变，如各种肿瘤的发生等。鉴于Pol S所具有的特殊生物学功能以及泛素蛋白修饰途径在DNA修复机制中的关键性作用，阐明Pol δ小亚基ρ12降解的泛素化修饰机制，对理解多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有着重要意义，而查找出特异性识别靶蛋白Ρ12的Ε3和介导Ρ12泛素化修饰的Ε2/Ε3调控系统已成为目前制约我们了解ρ12降解的泛素化修饰机制的瓶颈。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是建立体外泛素化分析手段，通过已知的泛素活 化酶El和以Hela SlOO馏分作为Ε3源，筛选出介导靶蛋白泛素反应的结合酶Ε2 ;采用多重层析柱组合，结合质谱分析，从人体细胞中查找特异性识别靶蛋白的泛素连接酶Ε3和调控靶蛋白泛素化修饰的Ε2/Ε3系统。通过这种方法，可以方便、准确地查找出识别靶蛋白的底物识别因子一泛素连接酶Ε3 ;建立介导靶蛋白泛素化修饰的Ε2/Ε3调控系统，解除制约“阐明ρ12降解的泛素化修饰机制”的瓶颈。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的 I.建立泛素化修饰反应的体外(In vitro)分析系统和Ε2的确定泛素反应的体外分析系统是以经纯化的GST融合蛋白作为基质，GST为对照，反应体系中还含有泛素，活化酶El,结合酶E2,连接酶E3,Ubiquitin aldehyde (抑制蛋白酶体泛素化水解和去泛素化酶的活性)，ATP能量再生系统。E2的确定过程是将以上反应混合物于反应缓冲液中30°C下反应60分钟。反应完成后，用Glutathione珠回收GST融合蛋白(靶蛋白)或GST的耦合物，SDS-PAGE电泳并转膜后，以抗泛素的抗体Western Blot检测祀蛋白-泛素I禹合物,从待选的多种E2中筛选出在已知El情况下介导靶蛋白多泛素化反应最强的、与未知E3配对的E2。上述反应体系中，所述的基质(靶蛋白)是经纯化后的带GST标签的DNA聚合酶Pol δ小亚基ρ12的融合蛋白。所述的泛素是从BostonBiochem公司购买的商业化人源泛素蛋白(Ubiquitin)。所述的活化酶El是从BostonBiochem公司购买的商业化人源重组UBEl(Ubiquitin El Enzyme)。所述的结合酶E2是从BostonBiochem公司购买的商业化人源重组UbcH5c、UbcH2、UbcH3 (Cdc34)以及 UbcH13/Uevla 复合物(以 UbcH13 表示)。所述的连接酶E3是指在上述的反应体系中，以BostonBiochem公司购买的商业化Hela细胞SlOO馏分作为E3源。所述的ATP能量再生系统是指从BostonBiochem公司购买的商业化ERS (EnergyRegeneration System)。所述的反应缓冲液是40mM Tris-HCl, pH 7. 5, 2 mM DTT, 5 mM MgCl20所述的抗泛素的抗体是指从Cell Signaling Technology公司购买的商业化兔源抗泛素的多克隆抗体。2.基于已知El和通过上述技术途径筛选出的E2对特异性识别靶蛋白的E3进行查找人体细胞抽提液经过4个本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于已知泛素活化酶E1查找特异性介导靶蛋白泛素反应结合酶E2和连接酶E3的方法，包括以下步骤：（1）建立泛素化修饰反应的体外分析系统和E2的确定：泛素反应的体外分析系统是以经纯化的GST融合靶蛋白作为基质，GST为对照，还包括：泛素，一种已知的活化酶E1，结合酶E2，未知的连接酶E3，Ubiquitin？aldehyde，ATP能量再生系统；E2的确定过程是将以上反应混合物于反应缓冲液中300C下反应60分钟；反应完成后，用Glutathione珠回收GST融合蛋白或GST的耦合物，SDS？PAGE电泳并转膜后，以抗泛素的抗体Western？Blot检测靶蛋白？泛素耦合物，从待选的多种E2中筛选出在已知E1情况下介导靶蛋白多泛素化反应最强的、与未知E3配对的E2；（2）对特异性识别靶蛋白的E3进行查找：人体细胞抽提液经过免疫亲和层析柱、Phenyl？Sepharose疏水层析柱、Mono？Q离子交换层析柱和Superdex？200分子筛层析柱4个不同性质的层析柱，每一步层析后，运用上述所建立的泛素反应体外分析系统，对各洗脱馏分检测E3的活性，合并含E3活性的洗脱馏分峰，再通过下一个层析柱，在最后一步层析后，对含E3活性馏分峰进行质谱鉴定，确定出特异性识别靶蛋白的E3。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张倩，周亚竟，陈慧卿，陈克平，麦维军，刘晓勇，何远清，李国辉，张磊，刘留，樊晓婷，宋惠芳，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：