一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，涉及污染物净化方法技术领域，技术方案为：(1)鼠李糖乳杆菌预处理；(2)调整含有展青霉素的液体体系的pH；(3)将步骤(1)预处理得到的鼠李糖乳杆菌加入到步骤(2)得到的液体体系中，摇床孵育后，将鼠李糖乳杆菌从液体体系中分离出去，即得到去除了展青霉素的液体。利用本发明专利技术提供的方法可以高效去除液体体系中的展青霉素，克服了现有技术中存在的技术问题，方法绿色环保，操作简单。

【技术实现步骤摘要】
一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法
本专利技术涉及污染物净化方法
，具体涉及一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法。
技术介绍
展青霉素(Patulin，PAT)是由丝衣霉属(Byssochlamys)、青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)等真菌产生的有毒代谢产物，是一种非挥发性的水溶性多聚乙酰内酯类真菌毒素。它广泛的存在于水果及其制品，尤其是果汁及果酱中，摄入展青霉素会引起肝和肾的各方面疾病，它还有致癌、致畸、致突变的性质，所以减少食品中展青霉素的含量对食品安全十分重要。表1及表2为欧盟及我国规定的食品中展青霉素的限量标准。表1欧盟规定的食品中展青霉素限量标准表2我国规定的食品中展青霉素的限量标准近年来，国内外学者研究了大量关于展青霉素脱除的技术。食品中展青霉素常用的脱除技术主要分为物理学方法、化学方法和生物学方法三大类。物理法是指采用各种物理手段来减少水果在贮藏期感染致病霉菌或降低已经产生的展青霉素含量。如调控水果及制品的贮藏条件(低温贮藏、气调贮藏等)；加强水果的人工拣选和清洗，果汁澄清处理及加热加压处理；物理吸附水果制品中的展青霉素；水果及其制品的微波处理及辐照处理、超声波处理等。挑选高质量的原料是减少食品中展青霉素的第一步，但是这种方法耗时又费力，影响手工操作者的身体健康，而且据报道展青霉素可以从腐烂部位渗透至未腐烂部位，在完整的水果部位仍然可以检测到展青霉素。加强原材料的清洗也可以有效降低产品中展青霉素的含量，但是清洗会使展青霉素进入清洗用水中造成清洗容器、工具及环境的二次污染。另外，在果汁加工过程中使用吸附材料进行吸附，过滤装置过滤以及加热加压等操作均能降低果汁中展青霉素的含量。但通常也会严重影响果汁的颜色并且大大降低总酚含量，同时也会影响果汁的其他形状。工业生产中去除果汁中展青霉素最常见的方法是树脂吸附。但树脂处理基本不会破坏果汁的颜色和风味，但会使展青霉素吸附到树脂材料上，对环境造成污染。化学方法主要有使用添加剂或化学杀菌剂等方法。但添加剂通常存在安全问题或安全隐患，而杀菌剂只能抑制展青霉素产生菌的生长和产毒，很少有能够直接去除食品中展青霉素的添加剂或杀菌剂见诸报道。生物学方法对展青霉素的去除作用近年来逐渐受到关注，且大部分集中在酵母菌对展青霉素的去除作用的研究上，这不仅限制了生物法在生产实际中的应用，而且酵母菌的加入对果汁的酸度、糖度和色泽等品质有一定的不良影响。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，技术方案为：(1)鼠李糖乳杆菌预处理；(2)调整含有展青霉素的液体体系的pH；(3)将步骤(1)预处理得到的鼠李糖乳杆菌加入到步骤(2)得到的液体体系中，摇床孵育后，将鼠李糖乳杆菌从液体体系中分离出去，即得到去除了展青霉素的液体。步骤(1)所述鼠李糖乳杆菌为生长到对数期的鼠李糖乳杆菌。步骤(1)所述预处理为酸处理或高温处理。所述酸处理，具体为，将鼠李糖乳杆菌菌体悬浮在酸处理液中震荡处理。所述震荡处理，震荡频率为100-200r/min，震荡处理时间为0.5-3h；所述酸处理液为2mol/L的HCl水溶液。所述高温处理，处理温度为120-130℃，处理时间为0.5-2h。步骤(2)所述调整含有展青霉素的液体体系的pH，调整pH至3.0。步骤(3)所述鼠李糖乳杆菌在所述液体体系中的菌体浓度为为2.5×109-1.25×1010CFU/mL。步骤(3)所述摇床培养，摇床转速为150r/min，温度为15-42℃，培养时间为4-12h。步骤(3)所述分离的方法为过滤或离心。当菌株和展青霉素混合培养时间为4h、反应温度为37℃、pH值为3、液体中展青霉素初始浓度为1000μg/L、菌体处于对数期时，菌株能达到最大的展青霉素去除率，且菌体浓度越高，吸附的毒素量越多。有益效果利用本专利技术提供的方法可以高效去除液体体系中的展青霉素，克服了现有技术中存在的技术问题，方法绿色环保，操作简单。展青霉素去除率，酸处理和121℃高温处理的去除率分别比活菌提高了21.37％和19.15％。附图说明图1展青霉素标准曲线；图2菌体处理方式对去除率的影响，图2注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；图3不同处理方式的菌体投射电镜观察(60000X)；注：图字母中分别代表不同处理方式获得的菌体，A为正常菌体；B为酸处理；C为碱处理；D为121℃热处理；E为100℃热处理；图4洗脱复合物的PAT结合率的变化，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；图5反应时间对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；图6反应温度对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；图7pH值对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；图8菌体浓度对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；图9菌体生长时期对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)。具体实施方式实施例中使用的菌株：鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)编号CICC20255，该菌株从菌种保藏机构(中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC))获取。培养基的配制：(1)MRS液体培养基(2)MRS固体培养基：在上述MRS液体培养基的基础上添加1.8％-2.0％琼脂，调节pH5.8。注：上述MRS培养基需要在121℃下高温灭菌15min后使用。试验用溶液配制：(1)PBS缓冲液137mmoL/L氯化钠，2.7mmoL/L氯化钾，10mmoL/L磷酸氢二钾，2.0mmoL/L磷酸二氢钾，pH调至7.4。(2)展青霉素的配制1.PAT贮备液:准确称取5mg的展青霉素标准溶液，溶于50mL乙酸乙酯中，充分混匀溶解，并使用0.22gm微孔滤膜进行过滤除菌后贮存于-200℃，得到浓度为100mg/L的展青霉素贮备液。2.PAT工作液:根据需要，准确量取一定体积的展青霉素标准品母液，用氮气吹干后溶于pH4.0水中，并定容至100mL，配制成不同浓度的展青霉素工作液。(3)酸处理液：取36.5％浓盐酸(12.6mol/L)15.9ml，冰水浴中加入到84.1ml蒸馏水水中，配制成2mol/LHCl。(4)碱处理液：取8g氢氧化钠固体加入到100mL蒸馏水中，配置成2mol/LNaOH溶液。展青霉素的高效液相色谱法检测：(1)检测条件:色谱柱UnitaryC18，150mm×4.6mm×5μm；柱温为30℃，流动相为甲醇:水＝10:90，流速1mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长276nm，上样量为20μL，展青霉素的出峰时间为7-8min。(SN/T2534-2010)(2)标准曲线绘制:用酸化水(冰醋酸调节pH值为4.0)配置不同浓度梯度(1500、1000、500、250、100μg/L)的PAT标准品，在高效液相色谱上进行定量检测，建立峰面积与PAT浓度之间的一元线性回归方程。结果如图1所示，由该曲线可以得出HPLC检测出的峰面积与PAT浓度的关系为：y＝0.0116x+38.298线性相关系数R2＝0.9992，在PAT浓度为250-1500μg/L的范围内，P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)鼠李糖乳杆菌预处理；(2)调整含有展青霉素的液体体系的pH；(3)将步骤(1)预处理得到的鼠李糖乳杆菌加入到步骤(2)得到的液体体系中，摇床孵育后，将鼠李糖乳杆菌从液体体系中分离出去，即得到去除了展青霉素的液体。

【技术特征摘要】
1.一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)鼠李糖乳杆菌预处理；(2)调整含有展青霉素的液体体系的pH；(3)将步骤(1)预处理得到的鼠李糖乳杆菌加入到步骤(2)得到的液体体系中，摇床孵育后，将鼠李糖乳杆菌从液体体系中分离出去，即得到去除了展青霉素的液体。2.根据权利要求1所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：步骤(1)所述鼠李糖乳杆菌为生长到对数期的鼠李糖乳杆菌。3.根据权利要求1所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：步骤(1)所述预处理为酸处理或高温处理。4.根据权利要求3所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：所述酸处理，具体为，将鼠李糖乳杆菌菌体悬浮在酸处理液中震荡处理。5.根据权利要求4所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：所述震荡处理，震荡频率为100-200r/min，震荡处...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佳栋，李春，刘丽波，陈晓倩，张硕，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23