一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，是以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10‑1‑A为出发菌敲除其甘油脱氢酶gdh基因和2,3‑丁二醇脱氢酶基因budC并且以来自Thermococcus profundus DT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶基因ldh构建出能用于生产乙偶姻的地衣芽孢杆菌工程菌株，然后以葡萄糖为底物，生物发酵该菌，由发酵液得到乙偶姻。实验证实本发明专利技术的工程菌可生产82.14克/升的乙偶姻，生产效率达到2.28克/升/小时，且该生产过程成本低，产量高，具有很好的应用价值和可观的经济效益。

A Method for Producing Ethylconjugate by Fermentation with Engineering Strains of Bacillus licheniformis

The present invention discloses a method for producing ethyl conjugate by fermentation of engineering strains of Bacillus licheniformis. The glycerol dehydrogenase GDH gene and 2,3 butanediol dehydrogenase gene budC of Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis) are knocked out and the lactate dehydrogenase gene LDH is replaced by the NADH oxidase gene NOx in Thermococcus profundus DT5432. The engineering strain of Bacillus licheniformis, which can be used to produce acetoin, is then fermented with glucose as substrate, and acetoin is obtained from fermentation broth. The experiment proves that the engineering bacteria of the invention can produce 82.14 grams/liter of ethyl couple, the production efficiency reaches 2.28 grams/liter/hour, and the production process has low cost, high yield, good application value and considerable economic benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法
本专利技术涉及一种发酵生产乙偶姻的方法，尤其涉及一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法。
技术介绍
乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)是一种挥发性的化合物，它广泛应用于食品添加、植物生长促进及生物害虫防治等。另外，乙偶姻还可以作为一系列化合物的化学合成前体物质，如双乙酰及含烷基吡嗪，其中后者包括2,3,5,6-四甲基吡嗪。鉴于乙偶姻广泛的用途及实现工业化生产的潜力，其被美国能源部列为30种优先发展的平台化合物之一。目前商业用乙偶姻主要来源是基于不可再生资源的化学合成方式，该工艺步骤复杂、反应条件苛刻、污染严重，且化学合成的乙偶姻在食品、医药、日化等领域的应用受到限制。也有众多研究者致力于利用微生物发酵实现乙偶姻的工业化生产，但相较于化学工艺方法，微生物发酵生产乙偶姻的成本依然较高。因此，降低乙偶姻产业对不可再生的石油资源的依赖，实现乙偶姻的绿色生产，提高微生物乙偶姻发酵工艺的经济竞争力，具有重要的经济效益和社会作用的意义。检索发现：已有多种微生物被报道可用于乙偶姻发酵生产，美国专利(US0815840)报道了通过高耐糖筛选及NTG诱变，获得了一株短小芽孢杆菌，乙偶姻产量达到63g/L。孙建安等人通过在粘质沙雷氏菌中外源表达NADH氧化酶提高胞内NAD+浓度，以葡萄糖为碳源，最终乙偶姻产量达到75.2g/L，这是目前报道中乙偶姻产量的最高值。然而，利用敲除副产物2,3-丁二醇合成途径的关键酶基因(gdh和budC)，并利用来自ThermococcusprofundusDT5432菌株中的NADH氧化酶基因(nox)替换地衣芽孢杆菌乳酸脱氢酶基因(ldh)降低副产物乳酸的产量方式构建地衣芽孢杆菌工程菌株，以实现乙偶姻的高效生产的方法还未见报道。
技术实现思路
针对该现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种利用构建的地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法。本专利技术所述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，步骤是：(1)以地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)10-1-A为出发菌，敲除地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)10-1-A甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶基因budC并且以来自ThermococcusprofundusDT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶基因ldh构建出能用于生产乙偶姻的地衣芽孢杆菌工程菌株，该工程菌株命名为地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox；其中，所述出发菌株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)10-1-A已于2011年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.5461；(2)以葡萄糖为底物，生物发酵地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox，由发酵液得到乙偶姻；其中，所述发酵条件是：培养温度为50±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为500±50转/分钟，旋转半径为33±1毫米，通气量为1.0±0.1vvm，培养时间为18～36小时；发酵培养基组成为：葡萄糖50～80克/升，酵母粉12克/升，无水乙酸钠6.5克/升，柠檬酸铵1克/升，磷酸氢二钾2克/升，七水硫酸镁0.25克/升，金属离子母液10毫升/升，余量为水；pH为7.0；其中的金属离子母液配方是：硫酸亚铁2.25克/升，硫酸锌0.75克/升，硫酸锰0.38克/升。上述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法中，步骤(1)所述工程菌株BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox的构建方法是：以地衣芽孢杆菌10-1-A基因组为模板，PCR获得包含gdh基因上下游同源序列的重组片段，连接至pKVM1后经双亲杂交转入地衣芽孢杆菌10-1-A，经抗性筛选单交换转化子；温度诱导发生双交换后，PCR筛选获得gdh基因成功敲除菌株，命名为地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdh；以地衣芽孢杆菌10-1-A基因组为模板，PCR获得包含budC基因上下游同源序列的重组片段，连接至pKVM1后经双亲杂交转入地衣芽孢杆菌licheniformisΔgdh，经抗性筛选单交换转化子；温度诱导发生双交换后，PCR筛选获得budC基因成功敲除菌株，命名为地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudC。以地衣芽孢杆菌10-1-A基因组为模板，PCR获得包含ldh基因上下游同源臂序列；以全基因合成的携带NADH氧化酶的质粒pUC57-nox为模板，PCR获得nox序列，将ldh基因上下游同源臂序列和nox序列重组PCR获得基因替换重组片段，连接至pKVM1后经双亲杂交转入地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudC，经抗性筛选单交换转化子；温度诱导发生双交换后，PCR筛选获得nox基因成功替换ldh基因的工程菌株，命名为地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox。上述地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox是革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧生长，蛋白分泌能力强，生长速率快，是一种公认的生物安全菌。其形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm，直径0.6μm～0.7μm，菌落颜色为红色或白色，产芽孢，VP反应呈阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含100g/LNaCl的培养基中生长，可在42～60℃条件下生长。上述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法中，步骤(2)所述发酵条件优选是：培养温度为50℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为500转/分钟，旋转半径为33毫米，通气量为1.0vvm，培养时间为25～36小时。上述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法中，底物葡萄糖的检测方法是：样品进行合适的稀释后，采用生物传感分析仪SBA-40D(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖氧化酶膜专一性测定葡萄糖含量。上述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法中，发酵产物乙偶姻的检测方法是：每500毫升乙酸乙酯中加入0.7毫升异戊醇，作为萃取剂；利用该萃取剂，对发酵液中发酵产物样品进行等体积萃取，利用涡旋振荡器对萃取的样品震荡30秒，然后静置，取上层样品进行气相检测。具体的气相检测条件如下：所用气相色谱仪的型号为Agilent6820，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均设为280℃；毛细管柱为SupelcoBeta-DexTM120(内径0.25毫米，长度30米)；检测过程的柱温设定为：40℃保持3分钟，然后以每分钟1.5℃的速率升温到80℃，以每分钟0.5℃的速率升温到86℃，以每分钟30℃的速率升温到200℃。进样量1.0微升，进行气相检测。本专利技术的特点和突出效果是：(1)本专利技术提供的地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox是高产乙偶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，步骤是：(1)以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10‑1‑A为出发菌，敲除地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10‑1‑A甘油脱氢酶gdh基因和2,3‑丁二醇脱氢酶基因budC并且以来自Thermococcus profundus DT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶基因ldh构建出能用于生产乙偶姻的地衣芽孢杆菌工程菌株，该工程菌株命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ΔgdhΔbudCΔldh::nox；其中，所述出发菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10‑1‑A已于2011年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.5461；(2)以葡萄糖为底物，生物发酵地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ΔgdhΔbudCΔldh::nox，由发酵液得到乙偶姻；其中，所述发酵条件是：培养温度为50±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为500±50转/分钟，旋转半径为33±1毫米，通气量为1.0±0.1vvm，培养时间为18～36小时；发酵培养基组成为：葡萄糖50～80克/升，酵母粉12克/升，无水乙酸钠6.5克/升，柠檬酸铵1克/升，磷酸氢二钾2克/升，七水硫酸镁0.25克/升，金属离子母液10毫升/升，余量为水；pH为7.0；其中的金属离子母液配方是：硫酸亚铁2.25克/升，硫酸锌0.75克/升，硫酸锰0.38克/升。...

【技术特征摘要】
1.一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，步骤是：(1)以地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)10-1-A为出发菌，敲除地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)10-1-A甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶基因budC并且以来自ThermococcusprofundusDT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶基因ldh构建出能用于生产乙偶姻的地衣芽孢杆菌工程菌株，该工程菌株命名为地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox；其中，所述出发菌株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)10-1-A已于2011年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.5461；(2)以葡萄糖为底物，生物发酵地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox，由发酵液得到乙偶姻；其中，所述发酵条件是：培养温度为50±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为500±50转/分钟，旋转半径为33±1毫米，通气量为1.0±0.1vvm，培养时间为18～36小时；发酵培养基组成为：葡萄糖50～80克/升，酵母粉12克/升，无水乙酸钠6.5克/升，柠檬酸铵1克/升，磷酸氢二钾2克/升，七水硫酸镁0.25克/升，金属离子母液10毫升/升，余量为水；pH为7.0；其中的金属离子母液配方是：硫酸亚铁2.25克/升，硫酸锌0.75克/升，硫酸锰0.38克/升。2.根据权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，其特征在于，步骤(1)所述工程菌株Bacillusliche...

【专利技术属性】
技术研发人员：高超，马翠卿，严金鑫，刘秋媛，张一鹏，
申请(专利权)人：山东大学深圳研究院，山东大学，
类型：发明
国别省市：广东,44