【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测分析，具体涉及一种用于去乙酰化酶抑制剂分析的探针及其制备方法和应用。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、赖氨酸乙酰化是一类重要的蛋白质翻译后修饰形式，包括组蛋白乙酰化和非组蛋白乙酰化。组蛋白乙酰化是一种重要的表观遗传调控机制，其有利于基因的表达与转录；非组蛋白乙酰化涉及多种关键细胞过程，如基因转录、dna损伤修复等。
3、去乙酰化酶(kdac)过度下调体内蛋白的乙酰化水平会导致各种疾病的发生，如癌症、神经退行性疾病等。因此，针对去乙酰化酶抑制剂(kdaci)的研究具有很大的应用前景。然而，专利技术人发现，由于细胞内源性的乙酰化肽丰度较低，目前通过质谱检测蛋白乙酰化需要用到大量的蛋白，分析难度较大。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种用于去乙酰化酶抑制剂分析的探针及其制备方法和应用。具体的，本专利技术研究开发了数种探针，通过使用含有末端炔基的乙酰基类似物作为探针分子来修饰蛋白，模拟对蛋白的乙酰化修饰，然后通过点击化学反应引入荧光基团或生物素，对被修饰的蛋白进行荧光凝胶成像或蛋白质谱分析，在此基础上分析kdaci对探针标记的影响，预测其对蛋白乙酰化的调控。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
2、具体的，本专利技术涉及以下技术方案：
3、本专利技术的第
4、
5、其中，n取自0-4的自然数，进一步的，
6、在式i中，n取自0,2或4；
7、在式ii中，n取自0或2。
8、具体的，本专利技术基于醋酸酐的反应活性，合成了上述丙炔酸酐、戊炔酸酐、丙炔酰基-n-羟基琥珀酰亚胺(丙炔酰-nhs)、戊炔酰基-n-羟基琥珀酰亚胺(戊炔酰-nhs)及庚炔酰基-n-羟基琥珀酰亚胺(庚炔酰-nhs)共计五种探针，使用探针对细胞进行标记之后，通过点击化学反应引入荧光基团(如罗丹明b-叠氮化合物)或生物素(生物素-peg-叠氮)，对被探针修饰的蛋白进行荧光凝胶成像分析。通过对不同活性反应基团和不同碳链长度的探针进行对比，筛选出了适合活细胞标记的探针，并用于后续对kdaci的分析。
9、本专利技术的第二个方面，提供上述探针的制备方法，所述制备方法包括如下合成路线：
10、
11、本专利技术的第三个方面，提供一种检测试剂盒，所述试剂盒至少包含上述探针。进一步的，所述检测试剂盒还可以包含其他任意已知试剂(如反应增强剂、酶试剂、缓冲液、清洗液)等，在此不做具体限定。
12、本专利技术的第四个方面，提供上述探针或检测试剂盒在去乙酰化酶抑制剂相关研究中的应用。
13、具体的，所述去乙酰化酶抑制剂相关研究至少包括：
14、(a)去乙酰化酶抑制剂对蛋白乙酰化的调控分析；
15、(b)去乙酰化酶及其抑制剂作用位点分析。
16、其中，所述应用均可在细胞内进行。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述细胞为hek 293t细胞。
17、其中，所述去乙酰化酶抑制剂包括但不限于saha、烟酰胺nicotinamide、丁酸钠sodium butyrate、丁苯羟酸bufexamac、ex527和agk2。
18、本专利技术的第五个方面，提供一种分析细胞内受去乙酰化酶抑制剂调控的潜在乙酰化蛋白的方法，所述方法包括：在上述探针标记细胞之前或之后孵育去乙酰化酶抑制剂，通过检测在细胞内积累的探针标记位点，分析受到kdaci调控的潜在乙酰化蛋白。
19、具体的，所述细胞为hek 293t细胞；
20、进一步的，所述方法包括：使用0.2-2mm(优选为1mm)丙炔酰-nhs探针孵育hek293t细胞1-6h(优选为3h)，然后加入去乙酰化酶抑制剂继续孵育1-24h(优选为3-21h，进一步优选为3-6h)；所述去乙酰化酶抑制剂包括但不限于saha、烟酰胺、丁酸钠、丁苯羟酸、ex527和agk2；进一步的，所述去乙酰化酶抑制剂为丁苯羟酸和ex527；更具体的，所述丁苯羟酸浓度250μm，所述ex527为1μm。
21、更进一步的，所述通过检测在细胞内积累的探针标记位点，分析受到kdaci调控的潜在乙酰化蛋白的方法包括：收集细胞，裂解提取蛋白并与生物素-peg-叠氮进行“点击化学”反应，用链霉亲和素富集蛋白后使用胰酶消化，最后将得到的肽段除盐并进行lc-ms/ms检测。
22、本专利技术的第六个方面，提供一种通过探针标记分析去乙酰化酶及其抑制剂作用位点的方法，所述方法包括：对细胞的全蛋白裂解液进行乙酰化反应，加入去乙酰化酶以及对应去乙酰化酶抑制剂，然后加入上述探针，对探针修饰的位点进行分析。
23、进一步的，所述去乙酰化酶为sirt1蛋白，所述去乙酰化酶抑制剂为ex-527；
24、进一步的，所述对探针修饰的位点进行分析具体方法包括：取探针标记后的蛋白制成上样样品，进行western blot，剩余蛋白与罗丹明叠氮进行点击化学反应，通过荧光凝胶成像分析探针标记的蛋白；然后根据荧光凝胶成像实验条件及实验结果，进行质谱样品质谱，并通过lc-ms/ms检测了sirt1在乙酰化的细胞裂解液中对蛋白乙酰化位点的调控作用及ex-527加入后，通过抑制sirt1的活性对蛋白乙酰化位点的调控。
25、以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
26、上述技术方案合成了数种带有炔基的不同碳链长度的探针，用于模拟对蛋白的乙酰化修饰。通过细胞毒性实验验证了较低的细胞毒性，通过荧光凝胶成像实验确认了探针能够进入细胞对蛋白进行标记，并优化了探针标记蛋白的条件。进一步的通过化学蛋白质组学技术系统的分析了kdaci对蛋白乙酰化的调控，并以sirt1为模型开发了通过探针标记来分析去乙酰化酶及其抑制剂作用位点的新方法，为研究其他相关去乙酰化酶及其抑制剂奠定了基础，因此具有良好的实际应用之价值。
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1.一种用于去乙酰化酶抑制剂分析的探针，其特征在于，所述探针具有如下结构式：
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，在式I中，n取自0,2或4；在式II中，n取自0或2。
3.权利要要求1或2所述探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下合成路线：
4.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含权利要求1或2所述探针。
5.权利要求1-2任一项所述探针或权利要求4所述检测试剂盒在去乙酰化酶抑制剂相关研究中的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述去乙酰化酶抑制剂相关研究至少包括：
7.一种分析细胞内受去乙酰化酶抑制剂调控的潜在乙酰化蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：在权利要求1-2任一项所述探针标记细胞之前或之后孵育去乙酰化酶抑制剂，通过检测在细胞内积累的探针标记位点，分析受到KDACi调控的潜在乙酰化蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞为HEK 293T细胞；
9.一种通过探针标记分析去乙酰化酶及其抑制剂作用位点的方法，其特征在于，所述方
10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述去乙酰化酶为SIRT1蛋白，所述去乙酰化酶抑制剂为EX-527。
...【技术特征摘要】
1.一种用于去乙酰化酶抑制剂分析的探针，其特征在于，所述探针具有如下结构式：
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，在式i中，n取自0,2或4；在式ii中，n取自0或2。
3.权利要要求1或2所述探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下合成路线：
4.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含权利要求1或2所述探针。
5.权利要求1-2任一项所述探针或权利要求4所述检测试剂盒在去乙酰化酶抑制剂相关研究中的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述去乙酰化酶抑制剂相关研究至少包括：
7.一种分析细胞内受去乙酰化酶抑制剂调控的...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡容，徐静，李雯雯，谭静，高灿，李梦轩，郭常川，
申请(专利权)人：山东大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：
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