本发明专利技术公开了一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术是以磷脂酶D为催化剂，并以PC60和L‑丝氨酸为底物，通过优化底物摩尔比、反应pH、温度、反应时间、酶添加量、盐离子种类及浓度等，发现底物摩尔比为磷脂：丝氨酸＝1:9‑11，pH选择5.5左右，反应温度45度，磷脂酶D酶液加量50U/g磷脂酰胆碱条件下，反应6小时后，磷酯酰丝氨酸(PS)产率为55.1％，底物磷脂酰胆碱(PC)剩余2％，几乎无副产物(PA)生成。
A Method for the Production of Phosphatidylserine by Phospholipase D Conversion
The invention discloses a method for preparing phosphatidylserine by phospholipase D conversion, which belongs to the field of biotechnology. The present invention is based on phospholipase D as catalyst and PC60 and L serine as substrate. By optimizing the molar ratio of substrate, reaction pH, temperature, reaction time, enzyme dosage, salt ion type and concentration, it is found that the molar ratio of substrate is phospholipid: serine=1:9 11, pH is about 5.5, reaction temperature is 45 degrees, and the dosage of phospholipase D solution is 50U/g phosphatidylcholine. After treatment, the yield of phosphatidylserine (PS) was 55.1%, and the remaining 2% of phosphatidylserine (PC) was obtained. There was almost no by-product (PA) formed.
【技术实现步骤摘要】
一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法
本专利技术涉及一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，属于生物工程
技术介绍
磷酯酰丝氨酸(简称PS)是存在于细菌、酵母、植物、哺乳动物细胞中的一种重要膜磷脂，也是大脑中的主要酸性磷脂。虽然在人体内数量很少，但其保健功效显著，具有改善老年人阿尔茨海默病、提高认知力、抗抑郁、抗压抑等功效。它可以影响信息间传递，被誉为继胆碱和DHA之后一大新兴“智能营养素”，可用于医药，食品等领域，作为食品添加剂添加在酸奶，奶粉及营养剂中。PS于2010年10月21日被原中国卫生部(现更名为国家卫生计生委)添加到新资源食品目录中，允许其作为新资源食品。目前中国市面上可随膳食一起食用的磷脂酰丝氨酸产品不多，常见的有美国的自然之宝记忆原素、GNC健安喜磷脂酰丝氨酸、Puritan'sPride脑磷脂PS、宝利美添加磷酯酰丝氨酸的藻油DHA软胶囊以及脑黄金磷脂酰丝氨酸DHA复合片。制备磷脂酰丝氨酸的方法主要有提取法和酶转化法。目前市面上出售的PS多是利用有机试剂氯仿/甲醇(2:1，v/v)从牛脑或大豆中提取，一方面提取工艺复杂且产量较少，另一方面由于疯牛病原因，其产品安全性也受到一定程度质疑。Sigma出售的从牛脑提取的纯度为97％的PS售价约为120元/mg，从土豆中提取的纯度为97％的PS售价约为62.68元/mg，阿拉丁等其他试剂公司售价与其类似。与提取法相比，酶转化法工艺简单，条件温和，产物收率高且低碳环保，这也表明了其市场前景广阔。然而，现有的酶转化法生产磷脂酰丝氨酸大多在有机相中进行，获得的产物安全性存疑，不适用于食品领域。而目前在水相中用酶转化法生产磷脂酰丝氨酸的副产物含量极高。Yugolwasaki等以PC70(质量分数为70％的磷脂酰胆碱)作为底物在纯水相中进行反应，反应24h，时仅获得约5％的PS，10％的副产物PA(甘油磷脂酸)，此时还有约80％PC未被消耗。SaovaneeChoojit等以PC50作为底物在纯水相中进行反应，反应结束时仅生成约26％的PS；DuanZhangqun等以PC98作为底物，在反应24h后也仅生成不到10％的PS，生成约40％的副产物PA，此时还有约50％的底物PC未被消耗。此外，现有的酶转化法生产磷脂酰丝氨酸大多以PC98(质量分数为98％的磷脂酰胆碱)为底物，成本较高，sigma公司目前出售的PC98价格为每100mg545元，成本较高，不适合大规模工业生产。我们目前使用的PC60价格则为每千克200元(报价来源于博帅天津生物科技有限公司)。ToshiyukiItoh和MagaretSivapragasam等人指出在离子液中也能进行转酯反应，虽然检测到了产物PS的生成，但离子液价格昂贵，工业化生产势必增加过多额外成本。因此，提供一种安全、副产物含量低、成本低廉、产率较高的磷脂酰丝氨酸生产方法，对于工业上制备磷脂酰丝氨酸具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，是以质量分数为30％-70％的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物，在水相中反应；磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:9-1:11，pH为5-6，温度为35-50℃，反应时间为6-12h，磷脂酶D添加量为50-70U/g磷脂酰胆碱，反应体系中添加了盐离子，所述盐离子包括氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾或氯化锌。在本专利技术的一种实施方式中，是以质量分数为60％的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物。在本专利技术的一种实施方式中，磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:10。在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中pH为5.5-6。在本专利技术的一种实施方式中，反应温度为40-45℃。在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中添加了质量分数为5-10％的盐离子。在本专利技术的一种实施方式中，添加质量分数为5-10％的氯化钙、氯化镁或氯化锌。在本专利技术的一种实施方式中，反应时间为5-10h。在本专利技术的一种实施方式中，反应时间优选5-6h。本专利技术的有益效果：本专利技术是以磷脂酶D为催化剂，并以PC60和L-丝氨酸为底物，通过优化底物摩尔比、反应pH、温度、反应时间、酶添加量、盐离子种类及浓度等，发现底物摩尔比为磷脂：丝氨酸＝1:9-11，pH为5.5左右，反应温度45℃，磷脂酶D添加量为50U/g磷脂酰胆碱，反应6小时后，磷酯酰丝氨酸(PS)产率为55.1％，底物磷脂酰胆碱(PC)剩余2％，几乎无副产物(PA)生成。且此方法得到的产物安全性较高、副产物含量低、成本低廉。附图说明图1：底物摩尔比对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。图2：缓冲液pH对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。图3：反应温度对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。图4：反应时间对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。图5：酶添加量对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。图6：盐离子种类对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。图7：盐离子浓度对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。具体实施方式(一)液相检测产物方法色谱柱为SepaxHP-Silica(250mm×4.6mm×5μm)，柱温为40℃，流速为1mL/min，蒸发光散色检测器漂移管温度为60℃，增益值为6，氮气流速为1L/min，流动相A为甲醇/水/醋酸/三乙胺(85:15:0.5:0.05)，B为正己烷/异丙醇/A(20:48:32)，洗脱程序为：0-5min100％B；5-15min22％A，78％B；15-27min90％A，10％B，27-28min100％A；28-32min100％A。实施例1优化底物摩尔比向100mL烧杯中加入50mL40mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝6)，再加入磷脂酰胆碱(PC60)10g和L-丝氨酸，其摩尔比依次选择为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11，升温到37℃，待底物完全溶解后加入5mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，反应6小时，转速300rpm，反应结束后检测PS、PA、PC的含量。如图1所示，磷酯酰丝氨酸的产率随磷脂酰胆碱与L-丝氨酸摩尔比的增加而增大，且向副产物PA方向转化变少。磷脂酰胆碱与L-丝氨酸的摩尔比为1:10时，磷酯酰丝氨酸的产率达到31.2％。实施例2优化缓冲液pH向100mL烧杯中分别加入pH为3、4、4.5、5、5.5、6、7的醋酸-醋酸钠缓冲液50mL，再加入磷脂酰胆碱(PC60)10g和L-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到37℃，待底物完全溶解后加入5mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，反应6小时，转速300rpm，反应结束后检测PS、PA、PC的含量。由图2可以看出，pH为5.5时，PS产率最高，达33.1％。实施例3反应温度优化向100mL烧杯中加入50mL40mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.5)，再加入磷脂酰胆碱(PC60)10g和L-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，分别升温到30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，待底物完全溶解后加入5mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，反应6小时，转速300rpm，反应结束后检测PS、PA、PC的含量。由图3可以看出，反应温度为45℃时，PS产率最高，达37.4％。实施例4反应时间优化向100mL烧杯中加入50mL40mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.5)，再加入磷脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，其特征在于，是以质量分数为30％‑70％的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物，在水相中反应；磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:9‑1:11，pH为5‑6，温度为35‑50℃，反应时间为6‑12h，磷脂酶D添加量为50‑70U/g磷脂酰胆碱，反应体系中添加了盐离子，所述盐离子包括氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾或氯化锌。
【技术特征摘要】
1.一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，其特征在于，是以质量分数为30％-70％的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物，在水相中反应；磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:9-1:11，pH为5-6，温度为35-50℃，反应时间为6-12h，磷脂酶D添加量为50-70U/g磷脂酰胆碱，反应体系中添加了盐离子，所述盐离子包括氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾或氯化锌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，是以丝氨酸和质量分数为60％的磷脂酰胆碱为底物。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，反应体系中pH为5.5-6。4.如...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏洪志，孙怡，朱宇雷，李江波，
申请(专利权)人：南通励成生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。