本发明专利技术公开了一种抗霉菌的芽孢杆菌属菌株及其筛选和应用。该菌株分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BYJ7，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 16705。本发明专利技术还提供了一种制备该芽孢杆菌培养液及其挥发性代谢物的方法。本发明专利技术所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及其挥发性代谢物对储粮(尤其是大米)中主要腐败菌的生长能够起到良好抑制作用，适用范围广、应用前景好、开发潜力强；且具高效节能、环境友好等特点，可应用于粮食防霉剂的制备。
【技术实现步骤摘要】
一种防霉芽孢杆菌菌株及其在粮食储藏中的应用
本专利技术属于新菌种筛选技术及微生物
，特别涉及一株抗霉菌的芽孢杆菌属菌株及其在粮食储藏中的防霉应用。
技术介绍
大米是我国南方地区主要粮食作物之一，然而由于受农户个体种植、贮藏方式，以及长江流域和华南地区高温高湿天气等诸多因素的影响，大米在仓储、运输和销售环节中受真菌毒素污染情况严重，极易发生霉变。国内外在大米保鲜方法上主要从以下几个方面进行了研究：一是研究大米陈化的机理，来控制陈化提高大米的存放期，延缓大米在储藏过程中水分、蛋白质、淀粉和脂肪等的变化；二是通过杀死大米上附着的成虫、虫卵、细菌或破坏其生长环境，从而抑制生物生长繁殖，来延长大米的储藏期；三是将大米与虫卵、细菌隔离，使之失去营养来源来提高大米的储藏品质(吴艳丽,潘丽爱.大米保鲜及储藏技术的研究进展.粮食工程·技术,2013,10:59-62)。其中，对于杀灭或抑制大米上致病菌这一方面，目前市面上主要采取的措施是采用保鲜剂或化学熏蒸。尽管运用化学防腐剂是为目前最为经济有效的办法，但由于剂量超标、使用频繁等原因，其对土壤、水体等环境污染也日益严重。残留在粮食中的化学杀菌剂通过食物链可进一步影响到人体健康，带来一定食品安全问题。基于上述原因，寻找和开发能够代替化学防腐剂且安全无污染的大米保鲜方法是为当前农业发展的一个必然。目前生物防霉剂已部分代替化学防腐剂被应用在肉类、果蔬等食品保鲜及加工中。但总体而言，目前对于大米等粮食的储藏保鲜方法主要是通过气调等环境控制或用化学熏蒸剂处理来控制微生物生长。芽孢杆菌是一种自然界中广泛存在的革兰氏阳性杆状细菌，其特征在于能够产生多种抑菌物质和酶类，具有较强的防腐作用，且分离培养容易，应用前景广。但目前，还未有将芽孢杆菌挥发性代谢产物应用到粮食防霉保鲜领域的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株抗霉菌芽孢杆菌属菌株及其应用方法，其挥发性代谢物可在粮食储藏过程中通过气调发挥防霉作用，是一种简单易行、高效环保的微生物处理方法，具有广阔的市场前景。本专利技术公开了一种抗霉菌芽孢杆菌属菌株，所述菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCCNo.16705，保藏日期：2018年11月5日。本专利技术还公开了一种抗霉菌芽孢杆菌属菌株的筛选方法，具体方法为：选用多区域分隔培养皿，隔板一侧加入马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA，用于培养黄曲霉菌；另一侧加入TSA或LB培养基以培养芽孢杆菌。实验组挑取已经活化的芽孢杆菌涂布至培养皿上，涂布区域保持一致；空白对照组则不进行上述涂布操作，之后用竹签挑取少量黄曲霉菌孢子以点涂方式接种至培养皿PDA培养基一侧区域的中心位置；接种完成、封口膜双层封口后，于25℃培养箱中倒置培养一周，且每隔24h测量各组黄曲霉菌菌斑直径，并计算抑菌率；选取抑菌率大于15％的菌株，以抑菌率为指标筛选出所述最佳抗霉菌芽孢杆菌属菌株。本专利技术的筛选方法具有普适性，能够推广到所有粮食防霉细菌的筛选,筛选得到的菌的发酵液可释放气体挥发物，该气体挥发物对霉菌抑制效果佳。本专利技术所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7是该方法筛选得到的其中一种所产气体挥发物抑制功效最好的菌株。本专利技术还公开了一种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7的发酵液制备方法，其特征在于所述方法为：将活化后的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7以2％-10％(v/v)接种量接种于装有TSA或LB液体培养基的锥形瓶中，37℃、180rpm密闭培养过夜，即得到含有挥发性抗菌代谢物的芽孢杆菌发酵液。本专利技术还公开了一种筛选最适合抗霉菌芽孢杆菌属菌株生长产气的培养基的方法。培养基筛选方法为：选用多区域分隔培养皿，其中隔板一侧加入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，用于培养黄曲霉菌；另一侧加入待筛选培养基(NB培养基，TSA培养基，TSB-YE培养基)以培养芽孢杆菌。剩余处理步骤以及检测指标与上述筛选抗霉菌芽孢杆菌属菌株方法相同。作为优选，所述芽孢杆菌属菌株培养基TSA培养基的配方为：15g胰蛋白胨，5g氯化钠，5g大豆蛋白胨，1.5％琼脂，1L去离子水。本专利技术所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7可以应用于制备粮食储藏熏蒸剂或保鲜剂，可以在粮食储藏中抑制黄曲霉、赭曲霉等霉菌的生长繁殖。所述的粮食优选为大米。本专利技术进一步公开了一种大米储藏方法：1)对封闭仓储环境进行清洁和消毒，放入干燥清洁的大米；2)使用所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7的发酵液：稀释发酵液，使得菌浓度为106-109CFU/mL；3)将大米与步骤2)中稀释后的发酵液在同一密闭空间进行熏蒸，稀释后的发酵液与储粮空间的体积比为0.5％-1％；保持60％-90％的相对湿度，置于20-30℃下保藏。模拟大米储藏实验中，将大米经消毒处理后接种黄曲霉菌，同时利用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7挥发性代谢产物对其进行熏蒸处理，观察大米发霉情况并根据国标GB4789.2-2016测定大米中菌落总数。研究发现地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7挥发性代谢产物对大米中的菌落总数有较明显的抑制作用，抑制率可达38％。通过上述方法，本专利技术筛选出一株微生物菌株，通过DNA凝胶回收试剂盒(GE0101)，pClone007VectorKit试剂盒(TSV-007)步骤和PCR方法提取纯化并扩增该菌株的基因组DNA，通过测定16SrDNA的序列来进行菌种鉴定。将该菌种所测得序列在GenBank数据库中进行BLAST对比分析，在比对匹配度最高的结果中发现与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)Pb-WC09001的16SrDNA序列同源性最高。可确定菌种为地衣芽孢杆菌，命名为BacilluslicheniformisBYJ7。该菌株的生物保藏信息为：中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号CGMCCNo.16705。本专利技术的有益效果：本专利技术所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7及其挥发性代谢物具备一定抗菌能力。根据模拟大米储藏试验结果，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7挥发性代谢产物能够在粮食储藏过程中抑制或延缓黄曲霉菌等腐败菌的生长，从而起到防霉保鲜作用，保障储粮安全。本专利技术所述芽孢杆菌本身抗逆性强，且抑菌谱广，可被应用于多种粮食仓储环境中，应用前景好、开发潜力强。本专利技术所述芽孢杆菌为天然粮食防霉剂，可在实际生产中代替大量化学熏蒸剂被使用，对人体及环境兼具安全性。附图说明图1本专利技术所述菌株BYJ7对黄曲霉抑制效果图(培养120h和192h)。其中左侧为对照组，右侧为处理组。图2本专利技术所述菌株BYJ7对黄曲霉抑菌效果曲线图。其中横坐标为培养时间，纵坐标为抑菌率。图3本专利技术所述菌株BYJ7在不同培养基条件下对黄曲霉抑菌效果本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗霉菌芽孢杆菌属菌株，其特征在于所述菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BYJ7，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.16705，保藏日期为2018年11月5日。
【技术特征摘要】
1.一种抗霉菌芽孢杆菌属菌株，其特征在于所述菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BYJ7，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCCNo.16705，保藏日期为2018年11月5日。2.一种抗霉菌芽孢杆菌属菌株的筛选方法，其特征在于所述方法为：选用多区域分隔培养皿，隔板一侧加入马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA，用于培养黄曲霉菌；一侧加入TSA或LB培养基以培养芽孢杆菌；实验组挑取已经活化的芽孢杆菌涂布至培养皿上，涂布区域保持一致；空白对照组则不进行上述涂布操作，之后用竹签挑取少量黄曲霉菌孢子以点涂方式接种至培养皿PDA培养基一侧区域的中心位置；接种完成、封口膜双层封口后，于25℃培养箱中倒置培养一周，且每隔24h测量各组黄曲霉菌菌斑直径，并计算抑菌率；选取抑菌率大于15％的菌株，以抑菌率为指标筛选出所述最佳抗霉菌芽孢杆菌属菌株。3.一种权利要求1所述抗霉菌芽...
【专利技术属性】
技术研发人员：周文文，张一鞠，刘姝妤，汤曦，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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