新型嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗癌症的用途制造技术

本发明专利技术公开一种新型嵌合抗原受体及其修饰的T细胞治疗癌症的用途。所述的新型嵌合抗原受体由胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域和胞内第二传导结构域组成，包含胞内第一传导结构域NKp44或胞内第一传导结构域TREM1。本发明专利技术分离纯化了多种嵌合抗原受体核苷酸序列，并提供了特异性针对CD19恶性血液肿瘤和mesothelin恶性实体肿瘤抗原的嵌合抗原受体及CAR‑T细胞。在血液肿瘤和实体肿瘤杀伤试验中，明显加强了CAR‑T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，在临床应用中展现出良好的安全性和抗肿瘤活性。

The Use of T Cells Modified by New Chimeric Antigen Receptor in Cancer Therapy

The invention discloses a novel chimeric antigen receptor and its modified T cells for cancer treatment. The novel chimeric antigen receptor consists of extracellular signal peptide, antigen binding domain, intracellular first conduction domain and intracellular second conduction domain, including intracellular first conduction domain NKp44 or intracellular first conduction domain TREM1. The invention isolates and purifies various chimeric antigen receptor nucleotide sequences, and provides chimeric antigen receptors and CAR T cells specifically targeting CD19 malignant hematological tumors and mesothelin malignant solid tumor antigens. In the killing test of hematological and solid tumors, the killing ability of CAR T cells to tumor cells was obviously strengthened, which showed good safety and anti-tumor activity in clinical application.

【技术实现步骤摘要】
新型嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗癌症的用途
本专利技术涉及肿瘤免疫治疗
，提供了治疗人癌症的组合物和方法。本专利技术包括涉及基因工程修饰的T细胞，以表达CAR，其中CAR包括抗原结合结构域、第一传导结构域和第二传导结构域。本专利技术还涉及编码此类跨膜多肽的核酸、载体，以及用于免疫治疗的在其表面表达所述CAR的免疫细胞。本专利技术开辟了对用于治疗癌症的有效的过继性免疫治疗策略的道路。
技术介绍
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(ChimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一[SchmitzM，etal.Chimericantigenreceptor-engineeredTcellsforimmunotherapyofCancer.JBiomedBiotechnol，2010，doi：10.1155/2010/956304.]。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，CAR能针对所选择的免疫细胞重定向其特异性和反应性，因此赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较与正常T细胞受体(TCR)应答不同，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。嵌合抗原受体(CAR)在T细胞上表达合成蛋白，其将抗体的抗原识别片段(如抗体单链可变区片段)与胞内信号结构域融合。在与表达scFv的同源抗原的靶细胞相互作用时，在T细胞上表达的CAR的表达引起T细胞激活杀伤靶细胞。目前CAR这些研究采用的是在scFv和CD3ζ链胞内结构域融合形成嵌合受体的基础上，加入4-1BB或CD28共刺激分子的第二代CAR-T细胞，以及在第二代CAR-T细胞的基础上，将两个共刺激分子4-1BB和CD28进行串联的第三代CAR-T细胞。基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意[GruppSA，etal.Adoptivecellulartherapy.CurrTopMicrobiolImmunol.，.2011；344：149-72.]。这些CAR都是基于单一嵌合分子设计的能够引发抗原特异性T细胞应答，但天然免疫受体通常是由分开的配体结合区和含ITAM的信号链组成的多链复合物，例如T细胞受体TCR-CD3复合物。多链免疫受体复合物的潜在益处是多方面的，包括通过配体结合和信号传导分子之间的多重相互作用获得的更大的信号多样性，以及持续的ITAM信号传导。相关研究报道新一代的CAR以跨膜受体DAP12与杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)组合形成CAR的信号传导结构[GenerationofpotentT-cellimmunotherapyforcancerusingDAP12-Basedmultichainchimericimmunoreceptors.CancerImmunologyResearch,2015,3(7):815-826.]，在众多配体中，DAP12由于能够和多种激活型受体结合形成免疫激活型复合物进而通过磷酸化Syk或Zap70介导激活型的信号受到格外关注。本专利技术提供一种新型的CAR结构，包含胞内第二传导结构域、T2A、胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域，例如胞内第二传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、肿瘤抗原结合结构域、胞内第一传导结构域TREM1(DAP12-T2A-CD8α信号肽-VL-Linker-VH-TREM1)。使用胞内第一信号传导结构和第二信号传导结构，利于CAR-T细胞受到胞外肿瘤抗原刺激时分泌更低水平的细胞因子，能够很好地保证临床应用的安全性，不仅在体外和体内有良好的肿瘤杀伤作用，而且在临床治疗实体瘤和血液肿瘤病人也展现出了显著疗效，而且细胞因子释放反应更为温和。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种安全性更好，疗效更加显著新型嵌合抗原受体及其应用。本专利技术的目的之二在于提供编码该嵌合抗原受体的核酸。本专利技术的目的之三在于提供含有该嵌合抗原受体的细胞及其应用。一种新型嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域和胞内第二传导结构域，其中所述第一传导结构域选自NKp44、NKp46、NKp30、NKG2D、TREM1或TREM2中的一种，第二传导结构域选自DAP12或FcεRγ中的一种。所述第一传导结构域NKp44的氨基酸序列优选SEQIDNO.9所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。所述第一传导结构域NKp46的氨基酸序列优选SEQIDNO.23所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。所述第一传导结构域NKp30的氨基酸序列优选SEQIDNO.24所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。所述第一传导结构域NKG2D的氨基酸序列优选SEQIDNO.25所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。所述第一传导结构域TREM1的氨基酸序列优选SEQIDNO.10所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。所述第一传导结构域TREM2的氨基酸序列优选SEQIDNO.26所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。所述的抗原结合域结合的抗原与恶性肿瘤有关，所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CEA、CTLA4、BCMA、CS1、c-Met、EPCAM、EGFR/EGFRvIII、gp100、GPC3、GD-2、IGF1R、IGF-Ireceptor、MAGEA3、mesothelin、MUC1、NY-ESO-1、HER2、PD1、PSMA、ROR1、WT1、糖脂F77或其他任意肿瘤抗原或其他修饰类型和其任何组合。所述的抗原结合结构域结合的抗原进一步优选为CD19或mesothelin中的一种；CD19抗原结合结构域氨基酸序列如SEQIDNO.12所示，mesothelin抗原结合结构域氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。所述的抗原结合结构域由抗体片段组成，优选单克隆抗体、Fab、scFv、VHH或其他抗体片段。其抗原结合结构域抗体可来自鼠源、骆驼源或人源化抗体。在具体实施例中，该嵌合抗原受体的抗原结合结构域由CD19或mesothelin中的一种特异性单链抗体片段组成，包括单链抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。在一个实施方案中，所述抗原结合结构域的单链抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)之间由连接肽(Linker)连接，包含GSLinker如(G3S)4或(G4S)3，优选(G4S)3连接肽。所述胞内信号结构域优选第一信号传导结构域包括NKp44、NKp46、NKp30、NKG2D、TREM1或TREM2的序列。进一步优选的，第二信号传导结构域包括DAP12或FcεRγ的序列。所述胞内第二传导结构域DAP12通过T2A与胞外信号肽和抗原结合结构域串联。优选的，所述DAP12氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述T2A氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域和胞内第二传导结构域，其中所述胞外信号肽选自CD8α信号肽、4‑1BB信号肽、GM‑CSFRα信号肽或CD4信号肽中的一种，胞内第一传导结构域选自NKp44、NKp46、NKp30、NKG2D、TREM1或TREM2中的一种，胞内第二传导结构域选自DAP12或Fcε受体γ(FcεRγ)中的一种。

【技术特征摘要】
1.一种新型嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、胞内第一传导结构域和胞内第二传导结构域，其中所述胞外信号肽选自CD8α信号肽、4-1BB信号肽、GM-CSFRα信号肽或CD4信号肽中的一种，胞内第一传导结构域选自NKp44、NKp46、NKp30、NKG2D、TREM1或TREM2中的一种，胞内第二传导结构域选自DAP12或Fcε受体γ(FcεRγ)中的一种。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，第二传导结构域DAP12通过T2A与胞外信号肽和抗原结合结构域串联；优选的，所述DAP12核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述T2A核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述胞外信号肽选自核苷酸如SEQIDNO.5所示的CD8α信号肽，氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；胞内第一传导结构域选自核苷酸如SEQIDNO.7所示的NKp44或SEQIDNO.8所示的TREM1，NKp44氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，TREM1氨基酸序列如SEQIDNO.10所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述的抗原结合结构域抗体选自单克隆抗体、Fab、scFv或VHH，其特征在于所述的抗原结合域结合的抗原与恶性肿瘤有关，包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CEA、CTLA4、BCMA、CS1、c-Met、EPCAM、EGFR/EGFRvIII、gp100、GPC3、GD-2、IGF1R、IGF-Ireceptor、MAGEA3、mesothelin、MUC1、NY-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王恩秀，汪晨，张海，
申请(专利权)人：南京卡提医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32