基于HRM-PCR的筛查早期膀胱癌的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种基于HRM‑PCR的筛查早期膀胱癌的试剂盒，所述的试剂盒用于检测待测样品中七个目的基因的甲基化水平，所述的试剂盒包括所述的七个目的基因的引物。本发明专利技术提供的试剂盒可以无创性、便捷、高效、快速诊断膀胱癌，膀胱癌风险值大于‑13.709时诊断为膀胱癌的特异性达94.6％，灵敏度达75.0％，受试者工作特征曲线(ROC)下面积达89.4％。

【技术实现步骤摘要】
基于HRM-PCR的筛查早期膀胱癌的试剂盒
本专利技术涉及诊断试剂盒
，具体是指一种基于HRM-PCR的筛查早期膀胱癌的试剂盒。
技术介绍
膀胱尿路上皮癌(以下简称“膀胱癌”)是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤。我国男性膀胱癌发病率居所有恶性肿瘤的第7位，女性排在第10位，男性发病率为女性的3～4倍。非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasivebladdercancer，NMIBC)占膀胱癌病例的75％，其中Ta期占70％，T1期占25％，原位癌(Tis，CIS)占5％。膀胱癌发病具有多中心、易复发、易侵袭、易耐药等生物学特性,即使NMIBC患者经过标准化治疗后，仍有患者术后出现肿瘤复发(50％～90％)或进展(10％～30％肿瘤肌层浸润或转移)，而且高级别T1G3和CIS膀胱癌有更高的复发进展率，肌层浸润性膀胱癌术后的5年生存率仅50％。因此，早期诊断是提高膀胱癌生存率的关键，但目前缺乏有效的早期筛查工具。血尿(肉眼或镜下血尿)是膀胱癌最常见的临床症状。根据指南标准化诊疗流程，对于血尿患者，首先进行经腹部膀胱超声检查，敏感性为63％～98％，特异性为99％，但是往往会漏诊膀胱微小病变(<1cm)或者膀胱原位癌(CIS)患者；或者行盆腔CT平扫，评估肿瘤位置及浸润情况，但仍容易漏诊CIS；当前两者检查为阴性时，仍需要麻醉下行膀胱镜检查，发现病变，并取活检，进行病理诊断。但是，在血尿患者中，最终只有不足10％的患者确诊为膀胱癌。因此，过度治疗的情况会出现在这些血尿病人中，特别是创伤性的膀胱镜检查以及昂贵的CT检查。目前，临床上常用的无创诊断方法对早期膀胱癌的检出效率并不高，因此，在本研究项目中，我们尝试从分子诊断水平进行膀胱癌的早期诊断研究，以避免不必要的CT检查或者膀胱镜检查。目前临床上可用的膀胱癌分子诊断方法对膀胱癌的诊断效能并不理想，并且相关研究的证据等级较低。比如UroVysion(FISH)、Microsatelliteanalysis、Immunocyt/uCyt+、NuclearMatrixProtein22、BTAstat、BTATRAK、Cytokeratins，这7个诊断手段的总体灵敏度分别为30～86％、58～92％、52～100％、47～100％、29～83％、53～91％、12～88％，总体特异度分别为63～95％、73～100％、63～79％、55～98％、56～86％、28～83％、73～95％[8,9-15]。因此，我们需要检出效率更高的膀胱癌诊断方法，由于尿液容易收集且经济，本申请中选用尿液中肿瘤细胞作为研究对象，在表观遗传学上，通过对尿液中肿瘤细胞DNA的甲基化水平进行评估，来探索DNA甲基化水平对膀胱癌早期诊断的作用以及对膀胱癌术后病人随访的意义。DNA甲基化主要出现在特定基因的启动子区中的CpG岛的胞嘧啶上以干扰转录因子的结合，由此使基因表达沉默。因此，检测肿瘤相关基因的启动子中的CpG岛的甲基化水平成为肿瘤研究的方向，并且广泛应用于肿瘤的诊断、进展及预后预测以及对抗癌治疗响应的预测。目前，DNA甲基化的检测对于肿瘤检测具有很高的特异性，已经成为膀胱癌研究的肿瘤标志物。研究已经发现许多与膀胱癌密切相关的DNA甲基化位点，比如位于BCL2、CDKN2A、NID2、TWIST1、ONECUT2、GDF15、TMEFF2、HOXA9、POU4F2、VIM、ZNF154、PENK和OTX1等基因上的甲基化。但目前尚无研究对这些甲基化基因进行筛选和综合评估，来评价这些分子标志物对膀胱癌的联合检测效能以及作为随访标志物的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服上述现有技术中的缺失，提供一种无创性、便捷、高效、快速的基于HRM-PCR的筛查早期膀胱癌的试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供的一种基于HRM-PCR的筛查早期膀胱癌的试剂盒，其具体包括：所述的试剂盒用于检测待测样品中七个目的基因的甲基化水平，所述的试剂盒包括所述的七个目的基因的引物，目的基因HOXA9甲基化的f1序列为：5'-GGGCGTGGGTTTTAGTTAGGAG-3'；目的基因HOXA9甲基化的r1序列为：5'-CCACCACCATCACCACCAC-3'；目的基因ONECUT2甲基化的f2序列为：5'-GGGAAGTAAGGYGGGTTGGG-3'；目的基因ONECUT2甲基化的r2序列为：5'-CTCTTCCCAACAAAACRCTCACCA-3'；目的基因PCDH17甲基化的f1序列为：5'-AYGGTGAGGGTGATAGTGTTAGA-3'；目的基因PCDH17甲基化的r1序列为：5'-CACAATACTCACCAAATAACCCAAACCAAC-3'；目的基因PENK甲基化的f1序列为：5'-GAAGAAGGTAAGTGTGAGGAGGG-3'；目的基因PENK甲基化的r1序列为：5'-CCCRCAACCTAACCCRTAACCC-3'；目的基因TWIST1甲基化的f2序列为：5'-YGGAGGAGAGAGTAGGAGGA-3'；目的基因TWIST1甲基化的r2序列为：5'-ACCTCRAAACCATCCACACC-3'；目的基因VIM甲基化的f1序列为：5'-AGGATAYGGATTTGGTGGATATGGTTG-3'；目的基因VIM甲基化的r1序列为：5'-CCCACCACCCACACCCA-3'；目的基因ZNF154甲基化的f2序列为：5'-GGGGAAGGTGTGTGAGGA-3'；目的基因ZNF154甲基化的r2a序列为：5'-CTATCCCCAAATCCCTACCA-3'；目的基因ZNF154甲基化的r2g序列为：5'-CTATCCCCGAATCCCTACCA-3'。较佳地，所述的试剂盒包括PCR反应试剂。附图说明图1为本专利技术的试剂盒的操作流程图。图2为尿液DNA甲基化诊断膀胱癌受试者工作特征曲线(临界值为-13.709时特异性达94.6％，灵敏度达75.0％，受试者工作特征曲线下面积达89.4％)。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，下面对本专利技术的具体实施方法作进一步说明。本申请中涉及的7个目的基因为：HOXA9、ONECUT2、PCDH17、PENK、TWIST1、VIM和ZNF154，主要专利技术构思为利用高分辨率熔解曲线PCR(HRM-PCR)技术，来检测尿液脱落细胞中7个目的基因的甲基化水平。与甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术相比，HRM-PCR的操作更简便、灵敏度更高、通量更高、成本更低。其中，七个目的基因的引物设计如下：HOXA9：Sequence-HOXA9-meth-f1:Tm57.75'-GGGCGTGGGTTTTAGTTAGGAG-3'Sequence-HOXA9-meth-r1:Tm56.05'-CCACCACCATCACCACCAC-3'ONECUT2：Sequence-ONECUT2-meth-f2deg:Tm59.25'-GGGAAGTAAGGYGGGTTGGG-3'Sequence-ONECUT2-meth-r2deg:Tm58.65'-CTCTTCCCAACAAAACRCTCACCA-3'PCDH17S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于HRM‑PCR的筛查早期膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于检测待测样品中七个目的基因的甲基化水平，所述的试剂盒包括所述的七个目的基因的引物，目的基因HOXA9甲基化的f1序列为：5'‑GGGCGTGGGTTTTAGTTAGGAG‑3'；目的基因HOXA9甲基化的r1序列为：5'‑CCACCACCATCACCACCAC‑3'；目的基因ONECUT2甲基化的f2序列为：5'‑GGGAAGTAAGGYGGGTTGGG‑3'；目的基因ONECUT2甲基化的r2序列为：5'‑CTCTTCCCAACAAAACRCTCACCA‑3'；目的基因PCDH17甲基化的f1序列为：5'‑AYGGTGAGGGTGATAGTGTTAGA‑3'；目的基因PCDH17甲基化的r1序列为：5'‑CACAATACTCACCAAATAACCCAAACCAAC‑3'；目的基因PENK甲基化的f1序列为：5'‑GAAGAAGGTAAGTGTGAGGAGGG‑3'；目的基因PENK甲基化的r1序列为：5'‑CCCRCAACCTAACCCRTAACCC‑3'；目的基因TWIST1甲基化的f2序列为：5'‑YGGAGGAGAGAGTAGGAGGA‑3'；目的基因TWIST1甲基化的r2序列为：5'‑ACCTCRAAACCATCCACACC‑3'；目的基因VIM甲基化的f1序列为：5'‑AGGATAYGGATTTGGTGGATATGGTTG‑3'；目的基因VIM甲基化的r1序列为：5'‑CCCACCACCCACACCCA‑3'；目的基因ZNF154甲基化的f2序列为：5'‑GGGGAAGGTGTGTGAGGA‑3'；目的基因ZNF154甲基化的r2a序列为：5'‑CTATCCCCAAATCCCTACCA‑3'；目的基因ZNF154甲基化的r2g序列为：5'‑CTATCCCCGAATCCCTACCA‑3'。...

【技术特征摘要】
1.一种基于HRM-PCR的筛查早期膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于检测待测样品中七个目的基因的甲基化水平，所述的试剂盒包括所述的七个目的基因的引物，目的基因HOXA9甲基化的f1序列为：5'-GGGCGTGGGTTTTAGTTAGGAG-3'；目的基因HOXA9甲基化的r1序列为：5'-CCACCACCATCACCACCAC-3'；目的基因ONECUT2甲基化的f2序列为：5'-GGGAAGTAAGGYGGGTTGGG-3'；目的基因ONECUT2甲基化的r2序列为：5'-CTCTTCCCAACAAAACRCTCACCA-3'；目的基因PCDH17甲基化的f1序列为：5'-AYGGTGAGGGTGATAGTGTTAGA-3'；目的基因PCDH17甲基化的r1序列为：5'-CACAATACTCACCAAATAACCCAAACCAAC-3'；目的基因PENK甲基化的f1序列为：5'-GAAGAAGGTAAGTGTGAGGAGGG-3'；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翔，那溶，张宁，陈思腾，吴亦硕，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31