本发明专利技术提供一种检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒，包括结合有子宫内膜癌抗体的磁珠及相应缓冲试剂，该试剂盒采用磁珠分选，逆转录‑多重PCR等分子生物学的方法检测子宫内膜癌患者血液循环中的肿瘤细胞的生物学活性，确定药物治疗靶点的基因，通过检测PAX8、ER和P53的表达水平，确定子宫内膜癌的发展及转归，对子宫内膜癌的个体化治疗提供理论依据和实验证据。本发明专利技术提供的试剂盒检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，检出率可达61.2％。
【技术实现步骤摘要】
一种检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及一种子宫内膜癌检测试剂盒，具体涉及一种准确性高的检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒。
技术介绍
子宫内膜癌(endometrialcarcinoma，EC)是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见，为女性生殖道三大恶性肿瘤之一，占女性全身恶性肿瘤7％，占女性生殖道恶性肿瘤的20％-30％。据统计，从2007年到2011年，子宫内膜癌的发病率每年增加了2.4％，死亡率每年增加了1.9％，5年期和10年期相对存活率是分别是82％和79％。1.子宫内膜癌临床诊疗现状及影响预后的相关因素1.1不同病理类型的子宫内膜癌，预后存在明显差别。Bokhman提出的子宫内膜癌的二元模型现在已经被广泛接受：I型子宫内膜癌多发生于处于绝经期或绝经前期的女性，并多有暴露于无拮抗的内源性或外源性雌激素的病史，与女性雌激素过多症有明显的相关性，如肥胖、无卵性的子宫出血、不孕症、多囊卵巢综合征、绝经后期和子宫内膜增生，是最常见的类型的子宫内膜癌，可达80％-85％，多为子宫内膜样腺癌，肿瘤分化程度较好，恶性程度一般较低，对孕激素类药物敏感，预后较好，5年生存率约为74％。Ⅱ型子宫内膜癌，是非雌激素依赖型，多发生于萎缩的子宫内膜中，形态学表现为低分化癌，多为浆液性乳头状廇、透明细胞癌等少见肿瘤，该类型肿瘤属高度恶性肿瘤，已发生深肌层浸润，预后比较差，5年的生存率在27％-42％。1.2子宫内膜癌临床期别不同，预后明显不同。子宫内膜癌病人大多因有绝经后阴道流血、不规则阴道流血等症状到医院就诊，通过诊断性刮宫术、子宫内膜活检可早期确诊得到及时的治疗。FIGO临床分期也是关于内膜癌的相关研究的标准参照之一。大多数的女性子宫内膜癌在早期诊断和手术可以治愈或没有辅助放疗，再结合手术方式改进，优化术后辅助治疗方案等，子宫内膜癌患者治疗生存率明显提高。子宫内膜癌术后的复发或转移是影响患者生存率的重要因素，也是导致死亡的重要原因。而对于疾病判定，其组织学分化越差，肌层浸润越深，盆腔淋巴结转移率越高，其预后就越差。研究表明高、中、低分化的5年生存率分别为94％、84％、72％。IA期高分化的患者，其5年生存率甚至可达到100％；而IB-IV期、高分化患者的生存率为67％；IB-IV期、低分化患者的生存率仅为26％，临床分期、肿瘤分化程度都是和子宫内膜癌预后相关的因素。但也有一些早期的子宫内膜癌会发生局部复发和远处转移，严重影响患者的生活质量，更是需要重视的问题之一。1.3子宫内膜癌治疗有规范的指南，但早期子宫内膜癌的辅助治疗并不统一确定。关于子宫内膜癌的治疗，目前国内外均采用的NCCN(NationalComprehensiveCancerNetwork，美国国立综合癌症网络，简称NCCN)推荐的指南，在其官方网站(www.nccn.org)会有定期更新，以方便临床使用，国内学者也会对NCCN指南进行相应的解读。在NCCN指南中，对于手术病理分期手术后的患者，是否添加辅助治疗方面，有些推荐，但并没有非常明确的指针界定，比如对于临床手术病理分期为FIGOIA、FIGOIB期的子宫内膜癌，根据其有无高危因素、病理分级(G1、G2、G3)不同，给予的治疗推荐为观察、腔内放疗、外照射、全身化疗等，或者联合添加不同辅助治疗方法，而是否添加的选择依据，并无客观循证医学证据，也未提供明确推荐方案。大多数子宫内膜癌会在早期即出现阴道出血、排液等症状，比较易于早期发现，临床中早期的子宫内膜癌占比最高，治疗以标准的子宫内膜癌分期手术治疗为主，NCCN有详细的手术相关说明，也是临床治疗参照的主要依据。但关于手术后的治疗，根据有无高危因素，如低分化子宫内膜样癌、有淋巴管瘤栓、高危组织类型(透明细胞癌、浆液性乳头状腺癌及腺鳞癌)等决定添加后续的放疗、化疗、激素等辅助治疗。但对于尤其是早期子宫内膜癌的辅助治疗添加与否、如何添加等方面，没有达成广泛的共识，临床选择术后辅助治疗方案也存在比较大的争议，在临床应用实践中，规范的手术病理分期后的辅助治疗添加与否，部分取决于主管医师的临床经验和主观选择，而临床早期、不伴有高危因素的患者，复发依然是影响远期预后的主要原因。这些都是临床诊治中的难以决策和达成统一共识的地方，有待进一步验证诊疗方案、积累临床经验、循证医学证据，并最终达成共识。探索辅助治疗添加的依据、评估临床预后，也是目前有待解决的问题之一。1.3近年我院复发性子宫内膜癌病例临床特点复发性子宫内膜癌一般资料收集2006年1月～2016年12月确诊为子宫内膜癌，接受标准子宫内膜癌分期手术，临床资料完整，随访肿瘤复发，接受再次手术或穿刺病理证实的病例22例。首次确诊子宫内膜癌的中位年龄为52岁(44～63岁)。临床症状有：绝经后阴道出血12例(54.5％)，阴道排液2例(9.1％)，非月经期阴道不规则出血4例(18.2％)，宫腔积脓/液1例(4.5％)，下腹痛2例(9.1％)，无症状体检超声发现1例(4.5％)。阴道超声提示宫腔内异常回声21例(95.5％)，子宫腔内存在异常血流信号12例(54.5％)。12例接受盆腔增强MRI检查，均提示宫腔内异常，其中8例患者提示子宫内膜结合带显示不清。术前均行子宫内膜病理检查，诊断为子宫内膜癌。术前临床分期FIGOI期18例(81.2％)，II期4例(18.2％)。合并高血压病者12例(54.5％)，合并糖尿病者8例(36.4％)。首次治疗情况均接受子宫内膜癌确定分期手术，全子宫+双附件切除+盆腔淋巴结切除+腹主动脉旁淋巴结切除术，术前诊刮子宫内膜病理或手术中冰冻病理证实为II型子宫内膜癌术中同时切除大网膜。I型子宫内膜癌18例(81.8％：高分化12例，中分化5例，低分化1例)，II型子宫内膜癌中4例(18.2％：浆液性腺癌3例，透明细胞癌1例)；肌层浸润<1/214例(63.6％)，肌层浸润>1/27例(31.8％)，肌层浸润达浆膜层1例(4.5％)；淋巴结阳性4例(18.2％)，均为盆腔淋巴结，腹主动脉旁淋巴结均阴性。临床病理分期(FIGO2009)IA期12例(54.5％)，IB期5例(22.7％)，II期1例(4.5％)，IIIC1期4例(18.2％)。按照NCCN指南，根据临床病理分期以及是否存在高危因素，决定是否添加辅助治疗。未接受任何辅助治疗12例(54.5％)，术后补充化疗4例(18.2％)，腔内放疗2例(9.1％)，盆腔外放疗2例(9.1％)，孕激素治疗2例(9.1％)。复发的诊断标准、复发时间、复发部位复发患者均接受再次手术或局部病灶穿刺活检，经病理证实为子宫内膜癌复发。第一次手术后到复发的确诊时间中位数4年(1.5～7年)，盆腔内复发14例(63.6％)，其中12例主要位于阴道断端区域，2例位于膀胱后方左侧；腹膜后髂血管周围淋巴结复发6例(27.3％)；前腹壁腹膜外转移合并肺转移1例(4.5％)；肺部转移1例(4.5％)。其中两例肺转移者均为FIGOIA期患者，伴有浅肌层浸润，高-中分化，可见不伴有复发高危因素的早期内膜癌，亦发生复发、远处转移。1.4无高危因素的早期内膜癌也存在复发、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由如下组分组成：结合有子宫内膜癌抗体的磁珠：结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；缓冲液A；100‑200mL缓冲液B：100‑200mL；裂解/结合缓冲液150‑250mL；10×缓冲液4.0‑5.0mL；dNTPs，5mM each 4.0‑5.0mL逆转录酶，10000U/μL 2.0‑3.0mLRNA酶抑制剂，40U/μL 0.4‑0.6mL2×多重PCR混合液2‑3mLRNase‑free水1‑2mL；子宫内膜癌肿瘤标志物引物10μmol/L 3.0‑5.0mL；其中所述子宫内膜癌肿瘤标志物为ER、PAX8和P53中的一种或多种；所述ER引物序列为：上游引物如SEQ ID NO：1所示；下游引物如SEQ ID NO：2所示；所述PAX8引物序列为：上游引物如SEQ ID NO：3所示；下游引物如SEQ ID NO：4所示；所述P53引物序列为：上游引物如SEQ ID NO：5所示；下游引物如SEQ ID NO：6所示；所述子宫内膜癌抗体为抗EpCAM单克隆抗体、抗MUC1单克隆抗体、抗CK20单克隆抗体。...
【技术特征摘要】
1.一种检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由如下组分组成：结合有子宫内膜癌抗体的磁珠：结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；缓冲液A；100-200mL缓冲液B：100-200mL；裂解/结合缓冲液150-250mL；10×缓冲液4.0-5.0mL；dNTPs，5mMeach4.0-5.0mL逆转录酶，10000U/μL2.0-3.0mLRNA酶抑制剂，40U/μL0.4-0.6mL2×多重PCR混合液2-3mLRNase-free水1-2mL；子宫内膜癌肿瘤标志物引物10μmol/L3.0-5.0mL；其中所述子宫内膜癌肿瘤标志物为ER、PAX8和P53中的一种或多种；所述ER引物序列为：上游引物如SEQIDNO：1所示；下游引物如SEQIDNO：2所示；所述PAX8引物序列为：上游引物如SEQIDNO：3所示；下游引物如SEQIDNO：4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭焕然，郭红燕，牛刚，张坤，
申请(专利权)人：北京牛牛基因技术有限公司，北京大学，北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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