一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及本一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒，包括用于检测CYP2D6基因的第2内含子、第6外显子、第5内含子和内参基因RPP30，使用实时荧光定量技术，快速准确的测定CYP2D6基因的拷贝数变化。使用本发明专利技术的试剂盒可在同一个反应条件下同时对3个与CYP2D6相关基因的位点进行高通量检测检测的特异性强，灵敏度高，最低检测限为1ng/μL，用时短，从标本送检到得出结果可在2小时以内完成。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒
本专利技术涉及CYP2D6基因多态性检测领域，更特别地，涉及一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒。
技术介绍
CYP2D6是CYP酶家族重要的成员之一，占肝脏酶总量的2-9％，但是参与20-30％药物的代谢，包括β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药(如销售额最大的阿立哌唑)、镇痛药等。CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶。CYP2D6位于第22号染色体上，共含有9个外显子和8个内含子，总长度约为5400bp，是一个完整的功能性基因。研究发现CYP2D6基因存在多态性和基因拷贝数重复等变异。目前已发现超过100种CYP2D6等位基因的变异，主要包括单核苷酸变异、大片段基因的丢失以及拷贝数变异。这些变异使CYP2D6基因呈现多态性，并决定其编码蛋白的酶活性表现为缺失、降低、正常或是增加等几种类型，进一步对药物的代谢同样表现出多样性。现阶段CYP2D6拷贝数异常检测的主要方法包括二代测序、微阵列芯片、荧光PCR等。这些方法或耗时长，操作复杂，或对操作者和实验场地有较高要求，或检测费用较高，或难以同时检测多个基因的不同突变位点。因此，有必要建立一种高通量、高效率、低成本的基因表达水平检测方法和产品，以实现快速检测及乳腺癌患者的普遍检测。
技术实现思路
我们在研究中发现，CYP2D6基因的个变异位点中影响中国人CYP2D6功能的常见变异有8个，包括快代谢型基因变异(基因拷贝数增多。包括型等位基因*1、等位基因*2)、中间代谢型基因变异(CYP2D6*9、*10、*14和*41)和慢代谢型基因变异(CYP2D6*3、*4和*5)。CYP2D6基因的这些变异可引起酶活性以及酶数量的差异，导致疗效不足或毒副作用的产生，最终产生药物疗效的个体差异。因此，CYP2D6的多态性研究对临床具有重要的意义，已经成为目前研究的热点。CYP2D6基因的拷贝数变化尤其重要，因为基因重复引起的拷贝数增加和基因缺失引起的拷贝数减少是影响CYP2D6酶活性增高和降低的重要原因。检测CYP2D6基因的单核苷酸多态性、寡核苷酸插入和缺失能够检测CYP2D6酶活性的缺失和降低，但是只有基因拷贝数的增加能够决定CYP2D6酶活性的增加。因此，CYP2D6基因拷贝数检测在临床应用具有重要意义。微流控技术是以微加工技术实现微体积反应，并可实现高通量反应使得手工操作和检测成本大幅降低，显著提高效率。基于以上研究，本专利技术提供了一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒，包括用于检测CYP2D6基因的多个区段的PCR扩增引物和荧光探针，以及参比基因的引物和探针。在一个优选实施方案中，所检测的CYP2D6基因的区段包括CYP2D6基因的第2内含子、第6外显子、第5内含子中的一个或多个。在一个优选实施方案中，用于检测第2内含子的引物对如SEQIDNO1和2所示，探针如SEQIDNO3所示。在一个优选实施方案中，用于检测第6外显子的引物对如SEQIDNO4和5所示，探针如SEQIDNO6所示。在一个优选实施方案中，用于检测第5内含子的引物对如SEQIDNO7和8所示，探针如SEQIDNO9所示。在一个优选实施方案中，所述参比基因为RPP30基因。在一个优选实施方案中，用于检测RPP30基因的引物对如SEQIDNO10和11所示，探针如SEQIDNO12所示。使用微流控核酸检测仪MF800，并应用12行×12列的设计的高通量微流控芯片阵列技术实现准确、快速和经济的同时检测CYP2D6基因的拷贝数变异的3个位点和1个内参基因，每一列的每个样品可以与微流控阵列中的3个拷贝数位点的探针，以及1个内参基因的探针反应。使用本专利技术的试剂盒可在同一个反应条件下同时对3个与CYP2D6相关基因的位点进行高通量检测。检测的特异性强，灵敏度高，最低检测限为1ng/μL，用时短，从标本送检到得出结果可在2小时以内完成。适用于对CYP2D6基因的检测及筛查。附图说明图1为使用实施例中的试剂盒检测得到的intro2分析结果的扩增曲线图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.位点的检测1.1检测技术和仪器为了能够快速高通量地检测这些突变，我们采用微流控技术，包括微流控芯片和微流控平台两个部分。微流控芯片是将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过气压、温度控制系统及荧光分析系统自动完成反应体系混合，实现多达9216个PCR反应。大大降低了手工加样的步骤和时间，完成整个过程约2小时。微流控芯片上都精密设置了许多微通道(样本、试剂、控制液通道)和微反应仓，预先在进样口分别加入试剂、样本和控制液，通过气压控制可实现芯片上的不同阀门开关，精准控制溶液在芯片通道内流动，在反应仓中混合，最多可以实现9216个nL级的PCR反应仓，进行实时荧光定量PCR反应。我们采用的微流控平台由AscendMF600型微流控核酸扩增仪(对应Fluidigm的Juno)和AscendMF800型微流控核酸检测仪(对应Fluidigm的Biomark)组成。AscendMF600型微流控核酸扩增仪(Juno)PCR与普通扩增仪的区别主要在于微流控技术，原理如下：微流控核酸扩增仪所使用芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过微流控核酸扩增仪气压控制系统和温度控制系统自动完成反应体系混合和PCR反应。微流控核酸扩增仪嵌入式PC控制系统可校准和监测仪器的性能，识别和记录芯片条码。利用触摸LCD显示屏，自定义和选择需要的试验程序。仪器采用的芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过气压控制系统控制样本及试剂在微流控芯片每一个微小的反应室内的精准流动和混合，温控模块实现PCR过程中快速、精确、均匀的升温/降温，在芯片上实现微流控PCR反应。完全取代人工操作，实现反应体系混合和PCR反应的全自动化。微流控核酸扩增仪包括气压控制系统及温控控制模块，气压控制系统通过真空泵的气压控制液体在微流控芯片中的精准流动，可作为芯片样本及试剂预处理控制器，嵌入式PC可校准和监测仪器的性能；温控模块控制PCR过程中快速、精确、均匀的升温/降温。用户可利用触摸LCD显示屏，自定义和选择需要的试验程序。微流控核酸检测仪原理类似于实时荧光定量PCR仪。原理如下：微流控核酸检测仪所使用芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，可自动完成PCR反应及结果分析。在PCR反应刚开始时，试剂量充足，模板和产物的浓度都足够低，产物不与引物竞争，扩增以恒定的指数速率增长。后期反应速率不再呈指数增长，扩增呈可变线性增长，进入线性增长期。在平台期，扩增速率趋近于零。1.2检测引物和探针设计微流控芯片与平台的结合可实现高通量快速的检测。但是，在一张芯片上，所有反应体系的反应条件是一致的，需要在引物和探针方面进行综合考虑，实现所有4种检测反应能在同一个反应条件下得到有效并且精确的检测结果。这给一次性检测不同的位点带来了很大难度。我们花了大量时间进行研究和实验验证，设计了以下引物和探针以实现一次性对上述4个位点进行有效而精确的检测。引物和探针的如表1所示。表1检测引物和探针编号名称序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，包括用于检测CYP2D6基因的多个区段的PCR扩增引物和荧光探针，以及参比基因的引物和探针。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，包括用于检测CYP2D6基因的多个区段的PCR扩增引物和荧光探针，以及参比基因的引物和探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所检测的CYP2D6基因的区段包括CYP2D6基因的第2内含子、第6外显子、第5内含子中的一个或多个。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测第2内含子的引物对如SEQIDNO1和2所示，探针如SEQIDNO3所示。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：萧锦华，王明璐，董志强，甘海燕，杨呈勇，
申请(专利权)人：广东腾飞基因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44