本发明专利技术涉及本一种用于检测CYP2D6基因突变的试剂盒，包括用于检测检测CYP2D6基因的单碱基置换、缺失突变等5种基因变异的检测试剂。使用本发明专利技术的试剂盒可在同一个反应条件下同时对5个与CYP2D6基因相关的突变进行高通量检测。检测的特异性强，灵敏度高，最低检测限为1ng/μL，用时短，从标本送检到得出结果可在2小时以内完成。
A Kit for Detecting CYP2D6 Mutation
The present invention relates to a kit for detecting CYP2D6 gene mutation, including five detectors for detecting CYP2D6 gene mutation, such as single base substitution, deletion mutation, etc. The kit of the invention can simultaneously detect five mutations related to CYP2D6 gene under the same reaction condition with high throughput. The detection has strong specificity and high sensitivity. The minimum detection limit is 1ng/muL. It takes only a short time. The results can be completed in less than 2 hours from the sample submission.
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测CYP2D6基因突变的试剂盒
本专利技术涉及药物代谢酶基因检测领域，更特别地，涉及一种用于检测CYP2D6基因的试剂盒。
技术介绍
据世界卫生组织(WHO)公布，世界各国住院患者发生药物不良反应的比例为10-20％，其中5％的患者死于严重药物不良反应。我国发生药物不良反应的患者占住院患者的10-30％，每年因药物不良反应入院的患者达500万人次，每年约有19万人死于药物不良反应。因此药物基因组学研究已经成为当前全球热点，个体化用药、个体化治疗更是各种医药生物国际学术会议的讨论重点。CYP2D6是CYP酶家族重要的成员之一，占肝脏酶总量的2-9％，但是参与20-30％药物的代谢，包括β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药(如销售额最大的阿立哌唑)、镇痛药等。CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶。CYP2D6位于第22号染色体上，共含有9个外显子和8个内含子，总长度约为5400bp，是一个完整的功能性基因。CYP2D6基因存在多态性，目前发现CYP2D6超过100个突变位点，主要包括单核苷酸变异、大片段基因的丢失以及拷贝数变异。这些变异使CYP2D6基因呈现多态性，并决定其编码蛋白的酶活性表现为缺失、降低、正常或是增加等几种类型，进一步对药物的代谢同样表现出多样性。因CYP2D6基因多态性与多种药物的临床应用相关，如：β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药等，包括：阿立哌唑、阿托西汀、文拉法辛、利哌利酮、塞托溴胺吸入、他莫昔芬、噻吗洛尔、氟西汀、奥氮平、西维美林、托特罗定、特比萘芬、曲马多、氯氮平、美托洛尔、普萘洛尔、卡维地洛、普罗帕酮、硫利达嗪、普罗替林、可待因、匹莫齐特、丁苯那嗪、伊潘立酮等。因此，对CYP2D6的基因分型检测可以用于以上多种药物的个性化用药辅助诊断。由于对临床具有重要的意义，CYP2D6的多态性研究已经成为目前研究的热点。目前国内外的检测CYP2D6基因突变的产品，如AmershamBioscience(GEhealthcare)的CodeLinkP450，Roche的AmpliChipCYP450Test等，价格昂贵，所需的检测时间较长，耗费人力，从核酸提取到结果获取超过8小时。而其它以PCR为基础的检测基因突变的技术，如直接测序法，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。另外目前也常用Taqman荧光探针法，但Taqman荧光探针法灵敏度低、假阳性率高、耗时较长，而且通量小。因此，需要一种新的检测CYP2D6基因基因突变的试剂盒及检测方法，使得对CYP2D6基因突变的灵敏度高，假阳性率高，通量大，且检测周期短。
技术实现思路
我们在研究中发现，影响中国人CYP2D6功能的常见突变有8个，包括酶活性正常型等位基因*1、*2，快代谢型基因变异为基因重复变异，慢代谢型基因变异*3、*4、*5，中代谢型基因变异*9、*10、*14、*41。这些基因基因突变可引起酶活性和数量的差异，从而影响药物的疗效个体差异，导致疗效不足或毒副作用的产生。基于以上研究，本专利技术提供了一种用于检测遗CYP2D6基因的试剂盒，其特征在于，包括用于检测CYP2D6*2、*3、*4、*5、*9基因型的检测试剂。在一个优选实施方案中，所述检测试剂包括用于扩增覆盖所述基因的突变位点的引物对，以及检测所述突变位点的探针。在一个优选实施方案中，所述CYP2D6基因的突变为CYP2D6*2、*3、*4、*5、*9的基因型。在一个优选实施方案中，所述CYP2D6基因的突变中，用于检测CYP2D6*2的引物对如SEQIDNO1和2所示，探针如SEQIDNO3和4所示；用于检测CYP2D6*3的引物对如SEQIDNO5和6所示，探针如SEQIDNO7和8所示；用于检测CYP2D6*4的引物对如SEQIDNO9和10所示，探针如SEQIDNO11和12所示；用于检测CYP2D6*5的引物对如SEQIDNO13和14所示，探针如SEQIDNO15所示；用于检测CYP2D6*9的引物对如SEQIDNO16和17所示，探针如SEQIDNO18和19所示。并应用12行×12列的设计的高通量微流控芯片阵列技术实现准确、快速和经济的同时检测CYP2D6基因的12个常见功能性基因点突变和拷贝数变异，功能性基因位点覆盖度高，检出率和准确度都较高；使用微流控核酸检测仪MF800，并应用12行×12列的设计的高通量微流控芯片阵列技术实现准确、快速和经济的同时检测多位点CYP2D6基因突变，每一列的每个样品可以与微流控阵列中的8个变位点(SNP)的探针反应。可以根据实验需要设置NTC、野生型、杂合型、突变型质控模板。本试剂盒可应用Taqman-MGB荧光探针法结合微流控技术，解决现有技术中CYP2D6基因检测灵敏度低、假阳性率高、周期长，通量小的技术问题。使用本专利技术的试剂盒可在同一个反应条件下同时对5个与CYP2D6基因的相关突变进行高通量检测。检测的特异性强，灵敏度高，最低检测限为1ng/μL，用时短，从标本送检到得出结果可在2小时以内完成。适用于对CYP2D6基因的检测及筛查。附图说明图1为使用实施例中的试剂盒检测得到的CYP2D6*2型分析结果的散点图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.突变位点的检测1.1检测技术和仪器为了能够快速高通量地检测这些突变，我们采用微流控技术，包括微流控芯片和微流控平台两个部分。微流控芯片是将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过气压、温度控制系统及荧光分析系统自动完成反应体系混合，实现多达9216个PCR反应。大大降低了手工加样的步骤和时间，完成整个过程约2小时。微流控芯片上都精密设置了许多微通道(样本、试剂、控制液通道)和微反应仓，预先在进样口分别加入试剂、样本和控制液，通过气压控制可实现芯片上的不同阀门开关，精准控制溶液在芯片通道内流动，在反应仓中混合，最多可以实现9216个nL级的PCR反应仓，进行实时荧光定量PCR反应。我们采用的微流控平台由AscendMF600型微流控核酸扩增仪(对应Fluidigm的Juno)和AscendMF800型微流控核酸检测仪(对应Fluidigm的Biomark)组成。AscendMF600型微流控核酸扩增仪(Juno)PCR与普通扩增仪的区别主要在于微流控技术，原理如下：微流控核酸扩增仪所使用芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过微流控核酸扩增仪气压控制系统和温度控制系统自动完成反应体系混合和PCR反应。微流控核酸扩增仪嵌入式PC控制系统可校准和监测仪器的性能，识别和记录芯片条码。利用触摸LCD显示屏，自定义和选择需要的试验程序。仪器采用的芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过气压控制系统控制样本及试剂在微流控芯片每一个微小的反应室内的精准流动和混合，温控模块实现PCR过程中快速、精确、均匀的升温/降温，在芯片上实现微流控PCR反应。完全取代人工操作，实现反应体系混合和PCR反应的全自动化。微流控核酸扩增仪包括气压控制系统及温控控制模块，气压控制系统通本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测CYP2D6基因突变的试剂盒，其特征在于，包括用于检测CYP2D6的一个或多个基因突变的检测试剂。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测CYP2D6基因突变的试剂盒，其特征在于，包括用于检测CYP2D6的一个或多个基因突变的检测试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括用于扩增覆盖所述基因的突变位点的引物对，以及检测所述突变位点的探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP2D6基因的突变为CYP2D6*2、*3、*4、*5、*9基因型的一个或多个。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP2D6基因的突变中，用于检测CYP2D6*2的引物对如SEQIDNO1和2所示，探针如SEQIDNO3和4所示。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP2D6基因的突变...
【专利技术属性】
技术研发人员：萧锦华，王明璐，董志强，甘海燕，杨呈勇，
申请(专利权)人：广东腾飞基因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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