一种miRNA检测试剂盒及其在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用制造技术

本发明专利技术提供了完整的能够方便快捷的检测miRNA检测试剂盒，无需另外订制特殊引物序列。另一方面通过本试剂盒检测AS病人血清中循环miR‑155的表达水平和斑块组织中miR‑155的表达水平，同时检测不同AS管腔狭窄程度患者血清中miR‑155的表达水平，进一步应用统计学方法分析miR‑155与AS常见风险因素的相关性分析以及应用ROC分析miR‑155对冠脉狭窄程度>75％诊断能力，探讨miR‑155在AS中表达以及临床意义，为AS的辅助诊断以及冠脉狭窄程度分级提供新的思路。

A Kit for Detecting MicroRNAs and Its Application in the Diagnosis of Coronary Stenosis

The invention provides a complete and convenient detection kit for microRNAs without the need to customize a special primer sequence. On the other hand, the expression level of circulating microRNA 155 in serum and in plaque tissue of AS patients were detected by this kit, and the expression level of microRNA 155 in serum of AS patients with different degrees of stenosis was also detected. The correlation between microRNA 155 and common risk factors of AS was further analyzed by statistical method, and the degree of coronary stenosis was more than 75 by ROC analysis. % To explore the expression of microRNA155 in AS and its clinical significance, and to provide new ideas for the diagnosis of AS and the classification of coronary stenosis.

【技术实现步骤摘要】
一种miRNA检测试剂盒及其在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及miRNA的检测试剂盒和其作为分子标记物在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用。
技术介绍
动脉粥样硬化(AS)的发病机制是一种多基因遗传、多级涉及免疫和血管管壁细胞成分的多发性、多阶段长期发展共同作用的复杂性疾病，可引起不同程度的血管管腔狭窄引发堵塞等临床严重事件，动脉系统中最常累及冠状动脉。冠状动脉粥样硬化进一步发展下去可使管腔变狭窄、血流量减少，心肌因缺血继而坏死，导致心绞痛、急性心肌梗死、室性心律失常和猝死等严重疾病；在过去的十年统计中，冠状动脉粥样硬化性心脏病一直位于世界十大死亡原因之一。在AS初级阶段，单核细胞会同时受到AS炎症反应刺激而释放的炎症因子及氧化应激的双重作用下，分化形成巨噬细胞，同时，巨噬细胞会摄食并累积氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)从而形成内皮下沉积的泡沫细胞，逐渐形成动脉粥样硬化斑块，进一步使管腔变狭窄，不同的冠脉狭窄程度会引起不同程度的临床事件。microRNA(miRNA)展现出在进化上高度保守，这类小分子RNA在一系列细胞病理生理学效果和分子信号通路中担任着不可或缺的角色。虽然miRNA在人类基因组中所占比例只有1％-3％，但人类基因的30％却被它们调控着；近年来有报道发现血液、尿液、胸腹水、脑脊液等体液中稳定地存在miRNA，使循环miRNA可能作为疾病诊断、预后生物学标志以及新的治疗靶点。越来越多的研究表明这些小分子RNA通过调控其靶基因的表达从而广泛参与到心血管疾病的病理生理进程中。在本项目中，我们主要聚焦于一种被MIR155宿主基因(MIR155HG)编码并由B细胞整合簇转录的miRNA：miR-155。目前已有许多报道表明，miR-155在炎症性疾病是一种多功能的miRNA，在不同的细胞、疾病程度、疾病类型中，miR-155可能发挥抑制炎症或促进炎症两种不同的作用，zhu等在他们的研究ApoE基因敲除并伴随高脂饮食的大鼠胸主动脉组织和AS病人的血浆标本中均发现miR-155明显升高，并进一步证实miR-155是通过靶向作用MAP3K10来调节其下游分析信号通路来抑制炎症因子的产生从而削弱了AS的病理进程。但是也有报道称miR-155可能促进AS进程，其可能机制有miR-155在ApoE基因敲除小鼠的骨髓细胞中通过抑制BCL6介导的CCL2的转录水平的抑制，从而促进了AS的发生发展。这些不同的研究结果皆表明miR-155在不同的细胞类型、病理进程和动物模型中有不同程度的升高，其可能参与动脉粥样硬化冠脉管腔狭窄病理进程中。中国CN201210406314.2号专利涉及抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法。具体地，miR-155表达的显著升高与动脉粥样硬化的严重程度呈现正向相关联，miR-155在动脉粥硬化小鼠(ApoE-/-/C57BL/6J)的腹腔巨噬细胞和血清中表达显著升高，oxLDL能特异性诱导小鼠的腹腔巨噬细胞表达和分泌miR-155；在oxLDL诱导的巨噬细胞中，miR-155表达量提高能促进脂质吞噬和活性氧生成；miR-155抑制剂可以显著抑制小鼠腹主动脉的斑块形成；miR-155是动脉粥样硬化疾病治疗一个重要靶点，miR-155抑制剂可以用于预防和治疗动脉粥样硬化。该专利未公开采用试剂盒测定miRNA的表达水平，试剂盒的组成，以及miRNA表达水平与动脉粥样硬化特定症状之间的关系。中国CN102168132A号专利公开了可用于对miRNA进行相对定量检测的一条茎环引物和多条配套扩增的引物、试剂盒和评价表。试剂盒包括试剂A：逆转录茎环引物混合液50μL；试剂B：M-MuLV逆转录酶；试剂C：逆转录缓冲液；试剂D：通用引物100μL；试剂E：miRNA特异性引物；试剂F：U6特异性引物；试剂G：TaqDNA聚合酶；试剂H：2×PCR缓冲液。本专利技术所提供的整套试剂盒可对不同类型T细胞的miRNA片段进行相对定量分析，并对个体免疫状态进行评估。该专利为公开miRNA表达水平与动脉粥样硬化特定症状之间的关系。目前国内外研究miRNA的检测手段主要是芯片技术、测序技术以及实时荧光定量PCR反应，芯片技术可以进行大规模的检测筛选，但由于成本较高且对检测标本要求严格，所以芯片技术不作为常规检测miRNA的方法；测序技术能够通过检测碱基种类从而精确确认miRNA的种类，但也存在成本花费高、耗时长且无法精准定量，故也不将其采纳为miRNA检测的常规方法；实时荧光定量PCR技术具有能够简单方便的进行操作，并能相对定量miRNA的含量，成本花费少等优点，使得其成为检测miRNA的常规手段，但纵观市面上大部分检测miRNA的PCR试剂盒，都需额外制定特殊的miRNA逆转录引物和定量PCR检测用上游和下游引物检测不方便。通过检测miRNA表达水平的高低能够判断动脉粥样硬化的严重程度，由于脉粥样硬化发病因素较多，使得患者冠脉管腔狭窄程度的诊断结果常常出现较大误差或误判，检测准确度低。因此，急需设计一种miRNA检测试剂盒及其在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种miRNA检测试剂盒及其在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用，本专利技术提供了完整的能够方便快捷的检测miRNA的试剂盒，无需另外订制特殊引物序列。另一方面通过本试剂盒检测AS病人血清中循环miRNA的表达水平和斑块组织中miRNA的表达水平，同时检测不同AS管腔狭窄程度患者血清中miRNA的表达水平，进一步应用统计学方法分析miRNA与AS常见风险因素的相关性分析以及应用ROC分析miRNA对冠脉狭窄程度>75％诊断能力，探讨miRNA在AS中表达以及临床意义，为AS的辅助诊断以及冠脉狭窄程度分级提供新的思路。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种miRNA检测试剂盒，由逆转录试剂、qPCR试剂组成，所述逆转录试剂包括：10μMmiRNA逆转录引物、10μMU6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂；所述qPCR试剂包括：10μMmiRNAqPCR上游引物、10μMmiRNAqPCR下游引物、10μMU6qPCR上游引物、10μMU6qPCR下游引物、2×Ultr动脉粥样硬化YBRMixture、双蒸水。所述逆转录试剂中10μMmiRNA逆转录引物、10μMU6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂的体积比为1-2:1-2:20-30:8-10:2-3。所述逆转录试剂中，10μMmiRNA逆转录引物、10μMU6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂的体积比为1:1:20:8:2。所述qPCR试剂中，10μMmiRNAqPCR上游引物、10μMmiRNAqPCR下游引物、10μMU6qPCR上游引物、10μMU6qPCR下游引物、2×Ultr动脉粥样硬化YBRMixture、双蒸水的体积比为1:1::1:5:5。本专利技术还提供一种miRNA检测试剂盒在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用，通过miRNA检测试剂盒检测血清中miR-155的表达水平，作为识别冠脉狭窄程度76-100％的独立本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA检测试剂盒，其特征在于，由逆转录试剂、qPCR试剂组成，所述逆转录试剂包括：10μM miRNA逆转录引物、10μM U6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂；所述qPCR试剂包括：10μM miRNA qPCR上游引物、10μM miRNA qPCR下游引物、10μM U6 qPCR上游引物、10μM U6 qPCR下游引物、2×Ultr动脉粥样硬化YBR Mixture、双蒸水。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA检测试剂盒，其特征在于，由逆转录试剂、qPCR试剂组成，所述逆转录试剂包括：10μMmiRNA逆转录引物、10μMU6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂；所述qPCR试剂包括：10μMmiRNAqPCR上游引物、10μMmiRNAqPCR下游引物、10μMU6qPCR上游引物、10μMU6qPCR下游引物、2×Ultr动脉粥样硬化YBRMixture、双蒸水。2.根据权利要求1所述的一种miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂中10μMmiRNA逆转录引物、10μMU6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂的体积比为1-2:1-2:20-30:8-10:2-3。3.根据权利要求2所述的一种miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂中10μMmiRNA逆转录引物、10μMU6逆转录引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢忠心，李晓怡，陈卫群，胡绘，吴唐维，刘水逸，
申请(专利权)人：武汉市中心医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42