检测TSC2基因位点突变的引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了检测TSC2碱基突变的引物，其特征在于，包括TSC2基因40230C>T突变区域；采用Sanger测序技术，可用于快速检测该突变位点。利用本发明专利技术完成的检测结果准确，不仅可以辅助诊断热点区域的突变情况，还可以作为判断突变位点对相关疾病影响的标准。TSC2基因的非激活突变会引起结节蛋白功能异常，影响其细胞分化调节功能，从而导致外胚层、中胚层和内胚层细胞生长和分化的异常，且突变可遗传。因此，针对TSC2基因突变进行检测对疾病的辨别和治疗便刻不容缓。

Primers, methods and kits for detecting mutations in TSC2 loci

The invention discloses a primer for detecting TSC2 base mutation, which is characterized by the mutation region of TSC2 gene 40230C > T, and can be used for rapid detection of the mutation site by Sanger sequencing technology. The detection result of the invention is accurate, which can not only assist in diagnosing mutations in hot spots, but also serve as a criterion for judging the impact of mutation sites on related diseases. The inactivated mutation of TSC2 gene can cause abnormal nodule protein function and affect its cell differentiation and regulation function, resulting in abnormal growth and differentiation of ectoderm, mesoderm and endoderm cells, and the mutation can be inherited. Therefore, detection of TSC2 gene mutation is of great urgency for disease identification and treatment.

【技术实现步骤摘要】
检测TSC2基因位点突变的引物、方法和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测TSC2基因突变的引物，采用普通PCR技术，可用于快速检测TSC2基因的突变情况。
技术介绍
结节性硬化症又称Bourneville病，是一种常染色体显性遗传的神经皮肤综合征，也有散发病例，多由外胚叶组织的器官发育异常，可出现脑、皮肤、周围神经、肾等多器官受累，临床特征是面部皮脂腺瘤、癫痫发作和智能减退。发病率约为1/6000活婴，男女之比为2：1。2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，结节性硬化症被收录其中。根据基因定位可分为四型：TSC1、TSC2、TSC3、TSC4。其中TSC1基因位于9号染色体，由23个外显子和22个内含子组成，TSC2基因位于16号染色体，由42个外显子和41个内含子组成，在体内作为抑癌基因广泛表达，表达产物Hamartin/TSC1和Tuberin/TSC2直接相互作用形成异二聚体(TSC1/TSC2)而起作用。TSC1和TSC2突变可导致一种显性遗传性多系统并发症，即复合型结节性硬化症(tuberoussclerosiscomplex，TSC)，具有很高的表现度和多样的并发表征，成人和小孩分别有1/8000和1/6000的几率受到TSC的影响。70％的结节性硬化症是由于体细胞突变所致，尤其是TSC2基因的突变，相比于TSC1基因的突变，TSC2突变会产生更严重的病理学特征。TSC1/TSC2能响应生长因子、胰岛素及各类环境胁迫信号，并发挥其靶向小G蛋白Rheb的GAP(gtpaseactiveprotein，GAP)活性，经由Rheb/mtorc1(mammaliantargetofrapamycincomplex1)模式信号途径来调控细胞生长、分化及迁移并在胚胎发育及机体代谢过程中发挥重要的功能。TSC2基因突变的频率高于TSC1，在患有结节性硬化症家庭中，TSC1基因突变只占到10～20％。TSC2基因的错义突变主要集中在TSC2蛋白C端的GTPase激活蛋白(GAP)结构域(外显子35到39)。突变的多样性和不同基因的参与部分解释了该疾病的表型多样性。TSC2：TSC1复合物在mTOR通路中的作用，如图1所示。PI3K通过与受体的直接相互作用或通过与支架蛋白(如IRS蛋白)的相互作用而被生长因子激活。这些相互作用使PI3K募集底物PIP2，从而产生脂质第二信使PIP3。Akt和PDK1通过PIP3与细胞质膜结合。使Akt的Thr308被PDK1磷酸化和Ser473被mTORC1磷酸化(未示出)而激活。一旦激活，Akt会磷酸化许多下游目标，包括TSC2上的多个位点。TSC2的磷酸化会抑制TSC2：TSC1复合物的GTPase活性，从而使Rheb-GTP积累。过量的Rheb-GTP激活高水平的mTORC1，进而磷酸化并抑制4E-BP1活性，激活S6K1和S6K2。综述TSC1和TSC2的分子遗传特性及其产物TSC1/TSC2在细胞生长调控中的作用。TSC1和TSC2突变分别引起错构瘤蛋白和结节蛋白功能异常，影响其细胞分化调节功能，从而导致外胚层、中胚层和内胚层细胞生长和分化的异常。遗传方式为常染色体显性遗传，家族性病例约占三分之一，即由父母一方遗传而来突变的TSC1或TSC2基因；散发病例约占三分之二，即出生时患者携带新突变的TSC1或TSC2基因，并无家族成员患病。家族性患者TSC1突变较为多见，而散发性患者TSC2突变较常见。根据受累部位不同，可有不同表现，典型表现为面部皮脂腺瘤、癫痫发作和智能减退。多于儿童期发病，男多于女。目前，对于TSC1和TSC2基因突变的报道很多，大多数TSC1和TSC2突变导致相应的开放阅读框的过早终止和突变等位基因的完全失活。然而，约25％的TSC2基因突变和1％的TSC1基因突变识别是非终止错义变化或少量碱基的删除或插入。这种非终止改变的后果是不容易预测的，导致致病性突变与中性(非致病性)变异的区分变得困难。因此TSC1和TSC2基因突变检测对于疾病的诊断、辨别和预防就显得至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测TSC2基因40号内含子位点突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测TSC2基因位点的突变情况。检测TSC2基因40230C>T突变情况的引物，其特征在于，包括：(1)扩增TSC2基因40230C>T突变点序列的引物：TSC2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAGGCAGTAGCCGAGATTSC2-R：AACAGCTATGACCATGGCTGAGGGAGCCCCATATTC(2)检测TSC2基因40230C>T突变点序列的测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。本专利技术第二个目的在于提供检测TSC2基因40230C>T突变情况的方法，包括以下步骤：(1)抽提血液中的基因组DNA；(2)用PCR扩增步骤(1)中提取的DNA；扩增TSC2基因40230C>T突变点序列的引物：TSC2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAGGCAGTAGCCGAGATTSC2-R：AACAGCTATGACCATGGCTGAGGGAGCCCCATATTC；(3)对步骤(2)中的扩增产物进行测序；检测TSC2基因40230C>T突变点序列的测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG；(4)对测序结果进行判断，确定TSC2基因位点是否发生突变。本专利技术第三个目的是提供一种检测TSC2基因40230C>T突变的试剂盒，包括(1)血液DNA抽提试剂；(2)PCR扩增反应体系试剂；包括扩增TSC2基因40230C>T突变点序列的引物：TSC2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAGGCAGTAGCCGAGATTSC2-R：AACAGCTATGACCATGGCTGAGGGAGCCCCATATTC；(3)测序体系试剂；包括检测TSC2基因40230C>T突变点序列的测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG；(4)阳性对照品和阴性对照品。有益效果：本专利技术设计了扩增TSC2基因40230C>T突变点序列的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本专利技术利用测序技术检测TSC2基因突变点的方法，可以一次将TSC2基因40230C>T突变类型检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计3个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大。附图说明图1为TSC2：TSC1复合物在mTOR通路中的作用机制示意图。图2为TSC2基因在染色体上的定位图。图3为TSC2基因40230C>T16例样本的电泳图。图4为TSC2基因40230C>T的测序截图。具体实施方式实施例1下面结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测TSC2基因突变情况的引物，其特征在于，包括：(1)扩增TSC2基因40230C>T突变点序列的引物：TSC2‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAGGCAGTAGCCGAGATTSC2‑R：AACAGCTATGACCATGGCTGAGGGAGCCCCATATTC(2)检测TSC2基因40230C>T突变点序列的测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。

【技术特征摘要】
1.检测TSC2基因突变情况的引物，其特征在于，包括：(1)扩增TSC2基因40230C>T突变点序列的引物：TSC2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAGGCAGTAGCCGAGATTSC2-R：AACAGCTATGACCATGGCTGAGGGAGCCCCATATTC(2)检测TSC2基因40230C>T突变点序列的测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。2.检测TSC2基因40230C>T突变情况的方法，包括以下步骤：(1)抽提血液中的基因组DNA；(2)用PCR扩增步骤(1)中提取的DNA；扩增TSC2基因40230C>T突变点序列的引物：TSC2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAGGCAGTAGCCGAGATTSC2-R：AACAGCTATGACCATGGCTGAGGGAGCCCCATATTC；(3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄开新，吴鹏飞，王淑一，
申请(专利权)人：武汉艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42