一种用于检测CREBBP基因突变位点的引物及试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测CREBBP基因突变位点的引物，所述CREBBP基因突变位点为所述CREBBP基因的CDS区第4450位T>G位点突变，所述引物为一对扩增引物，其包括上游引物F1和下游引物R1，其中上游引物F1的碱基序列如序列表SEQ ID NO：1所示，下游引物R1的碱基序列如序列表SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还公开了含有上述引物的试剂盒，以及上述引物和试剂盒在检测CREBBP基因第4450位T>G位点突变中的应用以及在预测复发的滤泡性淋巴瘤对西达本胺疗效相关性方面的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测CREBBP基因突变位点的引物及试剂盒和应用
本专利技术属于基因突变位点检测
，具体涉及一种用于检测CREBBP基因突变位点的引物及试剂盒和应用。
技术介绍
滤泡性淋巴瘤(FollicularLymphoma，FL)是B细胞非霍奇金淋巴瘤中发病率排名第二的疾病，仅次于弥漫大B细胞淋巴瘤。FL为惰性病程，中位生存时间达10～15年，但随着FL复发事件增多，生存期随之缩短，因此在FL复发后选择靶向药物提高缓解率及延长无进展生存期，是目前的研究方向。约40％的FL患者标本可检测到CREBBP基因(环磷腺苷效应元件结合蛋白，全称cAMP-responseelementbindingprotein，CREB，一种调节基因转录的蛋白质)突变，当CREBBP基因乙酰化酶结合区域(HAT)发生突变时，异常的乙酰化水平降低进而促进肿瘤发生。国产新药西达本胺为新型去乙酰化酶抑制剂(HDACinhibitor,HDACi)，可以提高乙酰化水平，恢复乙酰化的生理平衡状态，从而在携带CREBBP基因HAT区域突变的复发FL患者中发挥抗淋巴瘤作用。然而目前尚没有有效检测HAT区域突变位点的试剂盒及预测复发FL对西达本胺疗效的标志物。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于检测CREBBP基因突变位点的引物，该引物特异性好，能扩增出CREBBP基因突变位点。本专利技术的目的之二是提供一种用于检测CREBBP基因突变位点的试剂盒，该试剂盒能检测出CREBBP基因突变位点。本专利技术的目的之三是提供上述引物和试剂盒在检测CREBBP基因CDS区第4450位(参考序列为NM_004380.2)T>G位点突变中的应用以及在预测复发的滤泡性淋巴瘤对西达本胺疗效相关性方面的用途。本专利技术的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于检测CREBBP基因突变位点的引物，所述CREBBP基因突变位点为所述CREBBP基因CDS区的第4450位T>G位点突变，所述引物为一对扩增引物，其包括上游引物F1和下游引物R1，其中上游引物F1的碱基序列如序列表SEQIDNO：1所示，下游引物R1的碱基序列如序列表SEQIDNO：2所示。具体的，上游引物F1和下游引物R1的序列如下：上游引物F1：5'-CTTAAAGGCAGGGCCGATTT-3'；下游引物R1：5'-TATGCGAATGCAAGAAAAAGGCA-3'。进一步的，本专利技术中所述引物用于限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应RFLP-PCR。本专利技术的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于检测CREBBP基因突变位点的试剂盒，包括上述的引物。进一步的，该试剂盒中还包括限制性内切酶。优选的，所述限制性内切酶为MboII。本专利技术的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的引物和试剂盒在检测CREBBP基因CDS区第4450位T>G位点突变中的应用。以及上述的引物和试剂盒在预测复发的滤泡性淋巴瘤对西达本胺疗效相关性方面的用途。CREBBP基因p.F1484V(4450T>G)，位于CREBBP基因编码序列区(CDS区)16号染色体3736760位点发生T突变为G改变。本申请专利技术人首次发现CREBBP基因CDS区(4450T>G)与复发的FL对西达本胺疗效相关，CREBBP基因CDS区(4450T>G)可作为复发的FL对西达本胺疗效的预测指标。本专利技术具有以下优点：(1)本申请设计了用于检测CREBBP基因突变位点的引物以及试剂盒，通过引物和试剂盒能发现CREBBP基因CDS区(4450T>G)位点突变，而CREBBP基因CDS区(4450T>G)位点突变与复发的FL对西达本胺疗效相关，CREBBP基因CDS区(4450T>G)可作为复发的FL对西达本胺疗效的预测指标；(2)本专利技术的CREBBP基因CDS区(4450T>G)位点对预测复发的FL对西达本胺疗效有重要的意义，有很大的临床应用价值和很好的应用前景。附图说明图1是实施例3中CREBBP基因CDS区(4450T>G)核苷酸序列分析结果图；图2是实施例3中用PCR-MboII-RFLP琼脂糖凝胶法分析CREBBP基因CDS区(4450T>G)的结果图；其中，泳道M和5为100bpDNAMarker、泳道1为无疗效组PCR产物酶切后，泳道2为无疗效组PCR产物酶切前；泳道3为有疗效组PCR产物酶切后，泳道4为有疗效组PCR产物酶切前；图3是实施例3中携带CREBBP基因CDS区4450T>G复发FL患者的CT图像，A:口服西达本胺前患者腹膜后淋巴瘤病灶(4.3x2.5cm)；B:口服西达本胺30mgbiw治疗1个月后，淋巴瘤体积缩小≧50％；C和D:淋巴瘤体积进一步缩小达到CRu(不确定的完全缓解)；图4是实施例3中未携带CREBBP基因CDS区4450T>G复发FL患者的CT图像，左图是口服西达本胺前患者颈部淋巴瘤病灶(4.3x5.0cm)，右图是口服西达本胺30mgbiw6个月后淋巴瘤病灶达到SD(5.0x5.8cm)。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1用于检测CREBBP基因突变位点的引物设计在NCBI上确定CREBBP基因CDS区(4450T>G)位点的基因序列，采用PrimerPremier5.0软件对包含该位点在内的DNA片段设计扩增引物(上游引物5'-CTTAAAGGCAGGGCCGATTT-3'；下游引物：5'-TATGCGAATGCAAGAAAAAGGCA-3')，保证扩增产物被酶切后的片段长度尽量相差100bp以上，以便琼脂糖凝胶电泳能进行分辨。具体的，引物为一对扩增引物，其包括上游引物F1和下游引物R1，其中上游引物F1的碱基序列如序列表SEQIDNO：1所示，下游引物R1的碱基序列如序列表SEQIDNO：2所示。该引物为用于限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应RFLP-PCR。实施例2用于检测CREBBP基因突变位点的试剂盒设计本实施例提供的检测CREBBP基因突变位点的试剂盒，包括实施例1中的引物。进一步的，本实施例提供的检测CREBBP基因突变位点的试剂盒，包括实施例1中的引物和限制性内切酶。利用PrimerPremier5.0软件分析内切酶识别情况，确定限制性内切酶可以特异性识别该位点。本实施例中限制性内切酶为MboII。实施例3将实施例1中的引物和实施例2中的试剂盒用于检测CREBBP基因CDS区第4450位T>G位点突变以及预测复发的滤泡性淋巴瘤对西达本胺疗效相关性方面的研究(1)利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测CREBBP基因CDS区(4450T>G)位点；(2)收集2例复发的FL患者的肿瘤组织样本(表1)，将患者分为对西达本胺有疗效组和无疗效组，研磨组织后，采用QIAGEN试剂盒提取DNA；(3)利用实施例1中的引物和实施例2中的试剂盒，用2例复发FL患者的肿瘤组织DNA为模板扩增，获得PCR产物，确定酶切反应体系为30μL，包括以下成分：PCR产物14μL；10倍缓冲液(NEB公司Buffer)3μL；MboII限本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测CREBBP基因突变位点的引物，其特征是：所述CREBBP基因突变位点为所述CREBBP基因CDS区的第4450位T>G位点突变，所述引物为一对扩增引物，其包括上游引物F1和下游引物R1，其中上游引物F1的碱基序列如序列表SEQ ID NO：1所示，下游引物R1的碱基序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测CREBBP基因突变位点的引物，其特征是：所述CREBBP基因突变位点为所述CREBBP基因CDS区的第4450位T>G位点突变，所述引物为一对扩增引物，其包括上游引物F1和下游引物R1，其中上游引物F1的碱基序列如序列表SEQIDNO：1所示，下游引物R1的碱基序列如序列表SEQIDNO：2所示。2.根据权利要求1所述的用于检测CREBBP基因突变位点的引物，其特征是：所述引物用于限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应RFLP-PCR。3.一种用于检测CREBBP基因突变位点...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文瑜，刘思初，魏小娟，郭汉国，陈林杰，陈宇，黄玲，江新苗，陈菲莉，梁湛丽，
申请(专利权)人：广东省人民医院广东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：广东,44