一种近红外比率型荧光分子转子、制备方法及其在检测细胞内黏度和蛋白变性中的应用技术

本发明专利技术属于生化检测技术领域，具体涉及一种近红外比率型荧光分子转子、制备方法及其在检测细胞内黏度和蛋白变性中的应用。针对现有技术中近红外比率型检测黏度和蛋白变性的分子转子非常少，满足不了实际应用需求的问题，提供一种全新结构分子转子

A Near Infrared Ratio Fluorescent Molecular Rotor, Its Preparation and Application in Detecting Intracellular Viscosity and Protein Denaturation

The invention belongs to the field of biochemical detection technology, in particular to a near infrared ratio fluorescent molecular rotor, a preparation method and its application in detecting intracellular viscosity and protein denaturation. In order to solve the problem that there are very few molecule rotors for near infrared ratio detection of viscosity and protein denaturation in the existing technology, which can not meet the practical application requirements, a novel structure of molecule rotors is provided.

【技术实现步骤摘要】
一种近红外比率型荧光分子转子、制备方法及其在检测细胞内黏度和蛋白变性中的应用
本专利技术属于生化检测
，具体涉及一种近红外比率型荧光分子转子、制备方法及其在检测细胞内黏度变化和检测蛋白变性中的应用。
技术介绍
在生物系统中，细胞内黏度的变化与疾病息息相关，对黏度的检测显得尤为重要，越来越多的人试图探索一种新方法——使用分子转子来描绘局部微观粘度。分子转子荧光探针检测细胞内黏度的机理是：由于分子转子的旋转是非粘性介质中的有效猝灭途径，因此与转子部分偶联的荧光化合物会导致较弱的内在荧光；当其在粘性介质中时，旋转则受到限制，自由转动行为和消耗的激发能减少从而导致荧光增强，荧光量子产率增高。分子转子旋转受阻机理同样适用于对变性蛋白的检测。研究表明，各类蛋白质在发生变性后，不仅原来卷曲的紧密有序的结构发生改变，变化为无序松散的伸展链结构，二级结构中的α-螺旋结构均存在一定程度地向β-折叠结构转化的趋势。分子转子在以α-螺旋结构为主的正常蛋白中旋转相对自由，而在蛋白变性后的β-折叠结构中旋转受阻。由此可导致荧光强弱发生变化从而检测蛋白变性。许多疾病皆有蛋白质结构发生转变而产生的，因此关于蛋白变性检测的这项研究进展具有应用价值。在生物成像中，近红外发射十分有利于厚组织样品内信号的检测。穿透力更强使其能够提高对生物样品的探测深度。光毒性低大大降低了对样品的光损伤。同时还能有效避开细胞的自吸收和自发荧光，有利于提高信噪比。而且近红外比率型分子转子能够达到对细胞黏度定量的检测。然而，目前近红外比率型检测黏度和蛋白变性的分子转子非常少。七甲川菁是一个典型的近红外荧光团，且以七甲川菁作为荧光团的分子是目前极少数被FDA(美国食品药品监督管理局)批准用于临床的分子。但是七甲川菁对黏度和蛋白变性响应不敏感，稳定性差。因此，对于开发此类用于检测细胞内黏度和蛋白变性的近红外比率型分子转子十分有意义。
技术实现思路
针对现有技术中近红外比率型检测黏度和蛋白变性的分子转子非常少，满足不了实际应用需求的问题，本专利技术通过保留了近红外七甲川菁的主链结构，并通过链的环化，提高荧光稳定性，赋予其分子转子的特征，使其对黏度和蛋白变性响应敏感，从而开发一种全新结构的近红外比率型荧光分子转子。本专利技术一方面提供一种全新结构分子转子，是一种比率型荧光探针，其结构如下式(I)所示。式(Ⅰ)中：R1和R3分别为取代或非取代的杂环；L为取代或非取代的共轭碳链；X1为O或N；n为0～6；R2选自于H、卤素原子、取代或非取代的烃基、取代或非取代的环烃基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的杂芳基、取代或非取代的杂环基、取代或者非取代的醇基、取代或者非取代的醚基、取代或者非取代的醛基、取代或者非取代的羧基、取代或者非取代的酰氨基、取代或者非取代的酯基和取代或者非取代的氨基。式(Ⅰ)化合物具有比率型、长波长发射、大斯托克位移、对黏度和变性蛋白敏感的优点，能够作为分子转子用于细胞内黏度的定量检测以及蛋白变性的检测。优选地，所述R1和R3上分别包含N、O和S中的一个或多个杂原子。优选地，所述共轭碳链中包含2-5个双键；优选地，X1为N；优选地，所述R1、R3各自独立地选自于取代或者非取代的吡咯或氢化吡咯环、取代或者非取代的呋喃或氢化呋喃环、取代或者非取代的噻吩或氢化噻吩环、取代或者非取代的吡唑或氢化吡唑环、取代或者非取代的咪唑或氢化咪唑环、取代或者非取代的噁唑或氢化噁唑环、取代或者非取代的异噁唑或氢化异噁唑环、取代或者非取代的噻唑或氢化噻唑环、取代或者非取代的吲哚或氢化吲哚环、取代或者非取代的苯并呋喃或氢化苯并呋喃环、取代或者非取代的苯并咪唑或氢化苯并咪唑环、取代或者非取代的咔唑或氢化咔唑环、取代或者非取代的吡啶或氢化吡啶环、取代或者非取代的吡喃或氢化吡喃环、取代或者非取代的噻喃或氢化噻喃环、取代或者非取代的苯并吡唑或氢化苯并吡唑环、取代或者非取代的哒嗪或氢化哒嗪环、取代或者非取代的嘧啶嗪或氢化嘧啶环、取代或者非取代的吡嗪或氢化吡嗪环、取代或者非取代的哌啶环、取代或者非取代的吗啉环、取代或者非取代的硫代吗啉环和取代或者非取代的三唑环；优选地，所述R1选自于：其中，R5、R6、R6’各自独立地选自于H、卤素原子、取代或非取代的烃基、取代或非取代的环烃基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的杂芳基、取代或非取代的杂环基、取代或者非取代的醇基、取代或者非取代的醚基、取代或者非取代的醛基、取代或者非取代的羧基、取代或者非取代的酰氨基、取代或者非取代的酯基和取代或者非取代的氨基。进一步优选，所述L为进一步优选，n为3；进一步优选，R2为-CH3、更优选地，所述式(Ⅰ)化合物为化合物I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-6、I-7、I-8、I-9、I-10、I-11、I-12、I-13、I-14、I-15或I-16：本专利技术的第二个方面是提供制备上述化合物的方法，式II化合物与式化合物式III先进行Knoevenagel缩合反应，后经环化得到本专利技术式(Ⅰ)化合物。关环反应机理如下：本专利技术的第三个方面是提供上述的化合物在粘度测试、线粒体荧光标记、细胞内黏度定量检测或蛋白变性检测中的用途。本专利技术提供的式(Ⅰ)化合物是一种荧光染料，作为比率型荧光探针，荧光强度随环境粘度的增大而增强，荧光强度的对数和溶剂粘度的对数关系具有很好的线性关系，荧光强度与粘度的关系符合霍夫曼方程，并且具有较高斜率，其对粘度反应灵敏，激活倍数高。该化合物对蛋白质二级结构变化灵敏，蛋白质二级结构由α-螺旋转变为β-折叠结构时，荧光强度随之增强。本专利技术具有以下优点：式(Ⅰ)化合物适用于微观粘度的测试，并且由于其比率特性，可对细胞内黏度定量检测；还可与胰岛素、牛血清白蛋白等蛋白质结合，用于检测蛋白变性。制备方法简单，附图说明图1本专利技术近红外比率型荧光探针化合物I-1的合成路线；图2化合物I-1在水中的紫外吸收光谱图；图3化合物I-1在水中的荧光发射光谱图；图4化合物I-1在不同黏度溶液中的紫外吸收光谱图；图5化合物I-1在不同黏度溶液中的荧光发射光谱图；图6化合物I-1荧光强度的对数和溶剂粘度的对数关系图；图7已报道过的与本专利技术结构类似但对黏度没有响应的4种青色素类化合物结构ICG、Cy7-4、Cy7-6、Cy7-8；图8化合物I-1和ICG、Cy7-4、Cy7-6、Cy7-8的荧光强度与溶液黏度关系图；图9化合物I-1的荧光寿命随溶液的粘度的变化图；图10化合物I-1的荧光寿命随溶液的粘度的关系图；图11化合物I-1在490nm、710nm、710/490的荧光值对数和溶剂粘度的对数关系图；图12化合物I-1定位线粒体的显微成像图，图中a表示红色通道，b表示绿色通道、c表示组合；图13加入制霉菌素后的化合物I-1定位线粒体的显微成像图；图14细胞同一位置荧光强度与加入制霉菌素后时间关系图；图15化合物I-1在不同浓度的非变性BSA溶液中的荧光发射光谱图；图16化合物I-1在不同浓度的变性BSA溶液中的荧光发射光谱图；图17化合物I-1的荧光强度与变性BSA、非变性BSA浓度的关系图；图18化合物I-1在不同浓度的非变性胰岛素溶液中的荧光发射光谱图；图19化合物I-1在不同浓度的变性胰岛素溶液中的荧光发射光谱图；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用作近红外比率型荧光分子转子的化合物，其特征在于，该化合物的结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种用作近红外比率型荧光分子转子的化合物，其特征在于，该化合物的结构式为：式中：R1和R3均为杂环基，L为共轭碳链，X1为O或N，n为0～6；R2选自于H、卤素原子、烃基、环烃基、芳基、杂芳基、杂环基、醇基、醚基、醛基、羧基、酰氨基、酯基或氨基中的任意一种。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R1和R3上分别包含N、O和S中的一个或多个杂原子。3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述L包含2-5个双键。4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的烃基、环烃基、芳基、杂芳基、杂环基、醇基、醚基、醛基、羧基、酰氨基、酯基或氨基为取代的基团。5.根据权利要求1-4任一项所述的化合物，其特征在于，所述R1、R3各自独立地选自于吡咯、氢化吡咯环、呋喃、氢化呋喃环、噻吩、氢化噻吩环、吡唑、氢化吡唑环、咪唑、氢化咪唑环、噁唑、氢化噁唑环、异噁唑、氢化异噁唑环、噻唑、氢化噻唑环、吲哚、氢化吲哚环、苯并呋喃、氢化苯并呋喃环、苯并咪唑、氢化苯并咪唑...

【专利技术属性】
技术研发人员：周现锋，李志波，卢迎习，牟雪璐尔，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37