一种亚胺类吖啶荧光探针制备及标记口腔鳞癌细胞中bcl-2蛋白方法技术

本发明专利技术公开一种亚胺类吖啶荧光探针制备及标记口腔鳞癌细胞中bcl‑2蛋白方法，利用亚胺类吖啶对口腔鳞癌细胞中bcl‑2蛋白进行荧光标记，并与异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记进行光稳定性比较，本发明专利技术探针技术效果如下：1、吖啶荧光探针在荧光显微镜下，最大发射波长为470 nm。在荧光倒置显微镜下可见吖啶荧光探针对人舌癌Tca8113细胞中的bcl‑2蛋白标记明显，表现为蓝色；2、本发明专利技术有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统FITC标记方法相比较为优越。

Preparation and labeling of Bcl-2 protein in oral squamous cell carcinoma with imine acridine fluorescent probe

The invention discloses a method for preparing imine acridine fluorescent probe and labeling bcl_ 2 protein in oral squamous cell carcinoma cells. The fluorescent labeling of bcl_ 2 protein in oral squamous cell carcinoma cells with imine acridine is carried out and compared with fluorescein isothiocyanate (FITC) labeling in light stability. The technical effect of the probe is as follows: 1. The acridine fluorescent probe is fluorescent in fluorescence. Under the light microscope, the maximum emission wavelength is 470 nm. Under the fluorescence inversion microscope, it can be seen that acridine fluorescent probe can marked bcl_ 2 protein in human tongue cancer Tca8113 cells clearly, showing blue color. 2. The method has the characteristics of high sensitivity, simplicity, rapidity and accuracy, and is superior to the traditional FITC labeling method.

【技术实现步骤摘要】
一种亚胺类吖啶荧光探针制备及标记口腔鳞癌细胞中bcl-2蛋白方法
本专利技术涉及发光材料检测领域，具体涉及一种亚胺类吖啶荧光探针制备方法及利用该探针标记口腔鳞癌细胞中bcl-2蛋白的方法。
技术介绍
口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，其发生和发展由多因素导致。研究表明，细胞的凋亡在口腔癌发生和发展过程中有重要作用。Bcl-2蛋白是该领域研究较多的凋亡相关蛋白，bcl-2调节相关蛋白在口腔鳞癌中都有异常表达。长期以来，有机荧光一直被用来标记生物大分子以研究各种蛋白质之间的相互作用及对细胞的功能的影响。但是由于目前现有的荧光材料的缺点，例如光稳定性差，荧光寿命短等，限制了其作为标一记物在生物分子、细胞、体内生物成像研究中的应用。因此开发发光度强，有持久的光化学稳定性等荧光材料使其在生物医学领域的分子、细胞及体内的成像，尤其在肿瘤学的生物成像技术研究中，前景非常广阔。吖啶及其衍生物是一类由蒽中间环上的一个碳原子被氮原子取代而形成的含氮的三元环化合物，又称氮蒽。1871年，吖啶由CarlGräbe等人从煤焦油中提取并获得发展。吖啶类化合物拥有特殊的结构，且有很好的光学活性，是一种非常具有潜力的荧光探针。本专利技术使用亚胺类吖啶化合物作为荧光探针独特的光学特性观察口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白的定位及与传统的有机荧光异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）进行比较，然后使用亚胺类吖啶吡啶探针口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白进行免疫荧光成像研究，最后分析亚胺类吖啶吡啶探针对口腔鳞癌活细胞的影响，利用亚胺类吖啶吡啶探针对口腔鳞癌活细胞bcl-2蛋白进行观察。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于标记口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白的小分子荧光探针和应用。吖啶类的荧光反应体系较之其他的荧光化合物简单，不需要加入催化剂，在酸或者碱的体系中，就能发出强烈荧光，并且具有发光效率高，背景干扰小等特点，是一类具有广阔前途的荧光探针。本专利技术的另一目的是提供一类用于标记口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白的小分子荧光探针的合成方法，该方法具有操作方便、原料廉价、提纯简单等优点。本专利技术所采用的技术方案为：一种亚胺类吖啶荧光探针，其特征在于：该荧光探针具有如下结构，该荧光探针能与口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白结合：本专利技术所述的一种用于标记口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白的亚胺类吖啶荧光探针的合成方法，包括如下步骤：(1)中间体化合物I的合成:在装有冷凝管和搅拌子的双颈瓶中加入3mmol吖啶酮，充入N2，在N2气氛中加入6mlSOCl2，80℃下回流3h，待反应结束后，冷却至室温，将反应液边搅拌边缓慢滴入到冰水中，将冰，浓氨水和氯仿的混合液加入到上述液体中，分离氯仿层，用无水硫酸镁干燥，过滤，得到淡黄色液体，用乙酸乙酯：石油醚的体积比=1：2过柱色谱纯化，得到白色针状结晶，具有强烈的荧光的中间体化合物I；(2)中间体化合物II的合成：将中间体化合物I加入圆底烧瓶中，在70℃条件下溶于苯酚，加入2mmol碳酸铵，快速升温至120℃反应2h，待反应结束倒入10wt%的NaOH中，过滤，并依次用10wt%NaOH和水洗涤，得淡黄色固体，具有蓝色荧光的9-氨基吖啶中间体化合物II；(3)荧光探针III的合成：在圆底烧瓶中加入0.20mmol9-氨基吖啶溶于乙醇中，再加入0.25mmol4-醛基吡啶，在乙醇中80℃下回流4h，重结晶，得到荧光探针III。上述步骤(2)中，中间体化合物I和碳酸铵的摩尔比为1:3。所述的亚胺类吖啶荧光探针用于识别口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白。本专利技术还提供上述小分子荧光探针用于标记口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白。本专利技术具有以下有益效果：探针分子合成路线简单、反应条件温和、后处理简单方便。该类探针能成功标记口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白。探针与口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白结合之后，荧光强度发生了明显的变化，通过这种荧光变化，可以确定探针与口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白成功结合。发展一种可用于标记口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白具有特殊高表达的肿瘤细胞标记亚胺类吖啶类探针的光谱技术，为研究及治疗人舌癌Tca8113及相关肿瘤的临床治疗和相关机制研究提供很好的临床应用价值。附图说明图1本专利技术荧光探针和bcl-2蛋白作用前后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1×10-5mol/ml，bcl-2蛋白浓度为1×10-5mol/ml；图2本专利技术荧光探针与bcl-2蛋白反应的动力学图谱，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1×10-5mol/ml，bcl-2蛋白浓度为1×10-5mol/ml；图3本专利技术荧光探针在不同PH中的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光探针的浓度为1×10-5mol/ml，bcl-2蛋白浓度为1×10-5mol/ml。图4本专利技术荧光探针和异硫氰酸荧光素（FITC）光稳定性比较图。图5本专利技术荧光探针和bcl-2蛋白及其作用后，在荧光倒置显微镜下的对照图谱。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1：用于蛋白标记的小分子荧光探针的合成（1）中间体化合物I的合成：在装有冷凝管和搅拌子的双颈瓶中加入3mmol吖啶酮，充N2，在氮气的气氛中加入6mlSOCl2，在80℃下回流3h，待反应结束后，冷却至室温，将反应液边搅拌边缓慢滴入冰水中，将冰，浓氨水和氯仿（物质量比为1:1:1）的混合液加入到上述液体中，分离氯仿层，干燥（无水硫酸镁），过滤，得到淡黄色液体，用乙酸乙酯：石油醚的体积比=1：3过柱色谱纯化，得到白色针状结晶，具有强烈的荧光的中间体化合物I，产率86％。将中间体化合物I（9-氯吖啶）在圆底烧瓶中在70℃下将1mmol9-氯吖啶溶于苯酚，加入2mmol碳酸铵，快速升温至120℃反应2h，待反应结束倒入10%的NaOH中，过滤，并用10%NaOH和水洗涤，得淡黄色固体，具有强蓝色荧光的9-氨基吖啶中间体化合物II，产率93％。(2)荧光探针III的合成：在圆底烧瓶中加入0.20mmol9-氨基吖啶溶于乙醇，再加入0.25mmol4-醛基吡啶，在乙醇中80℃下回流4h。重结晶，得到所需荧光探针III。产率90％。实施例2：荧光探针与口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白标记后的荧光变化Tris-HCl溶液配制为0.05mol/LPH=7.4（内含浓度为0.1mol/L的NaCl溶液）。在4ml的EP管中加入1mlTris-HCl溶液，1ml实施例1制得的浓度为1×10-5mol/L的溶液荧光化合物（荧光探针III）和1ml的超纯水配成对照溶液，与加入浓度为1×10-5mol/Lbcl-2蛋白后的荧光强度作对比。用2mm的石英比色皿，经反复测量以激发波长260nm为最佳，仪器灵敏度调整为1，波长范围为285～500nm之间，激发和发射的狭缝为5nm，电压500v，扫描速度为1200nm/min，测定化合物（荧光探针III）的荧光强度变化。测定荧光得到图1。图1中只有荧光探针III存在时荧光强度为1000。而当荧光探针III与bcl-2蛋白反应后，荧光有显著的增强到1800，发射波长约为430和470nm。实施例3：荧光探针与bcl-2蛋白反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种亚胺类吖啶荧光探针，其特征在于：该荧光探针具有如下结构，该荧光探针能与口腔鳞癌细胞bcl‑2蛋白结合：

【技术特征摘要】
1.一种亚胺类吖啶荧光探针，其特征在于：该荧光探针具有如下结构，该荧光探针能与口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白结合：。2.一种用于标记口腔鳞癌细胞bcl-2蛋白的亚胺类吖啶荧光探针的合成方法，包括如下步骤：(1)中间体化合物I的合成:在装有冷凝管和搅拌子的双颈瓶中加入3mmol吖啶酮，充入N2，在N2气氛中加入6mlSOCl2，80℃下回流3h，待反应结束后，冷却至室温，将反应液边搅拌边缓慢滴入到冰水中，将冰，浓氨水和氯仿的混合液加入到上述液体中，分离氯仿层，用无水硫酸镁干燥，过滤，得到淡黄色液体，用乙酸乙酯：石油醚的体积比=1：2过柱色谱纯化，得到白色针状结晶，具有强烈的荧光的中间体化合物I；(2)中间体...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯方，骆兵，卢梅秀，吴斌，苏慧敏，林媚，陈艳，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35