本发明专利技术公开了一种喹哪啶类化合物作为hCBS酶抑制剂的应用，具体涉及化合物喹哪啶蓝作为hCBS酶抑制剂的应用。该小分子化合物对离体hCBS酶促反应的IC50为20μM，可以作为研究H2S信号通路的工具药，以及开发治疗循环休克、中风、唐氏综合症和肿瘤等与H2S相关的疾病的药物的先导化合物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种hCBS酶抑制剂的应用。
技术介绍
人体内源性的H2S气体分子参与并调控很多生理和病理过程，为重要的信号转导通路的调控分子。在结肠癌、神经退行性疾病、缺血性中风、低血压、高血压和胰腺炎等很多病理条件下，内源性H2S含量都发现有异常变化。因此，目前需要内源性H2S信号的特异抑制剂或激活剂作为分子探针工具去进一步阐述H2S的生理功能，和治疗与H2S-相关的疾病的小分子药物先导物。CBS(cystathionineβ-synthase,胱硫醚-β-合成酶)是一种PLP-依赖型(pyridoxal-5’-phosphate-dependent)酶，即维生素B6依赖型酶。在人体内，CBS催化底物L-半胱氨酸(Cysteine)和L-同型半胱氨酸（L-Homocysteine）产生内源性H2S气体。在循环休克、中风、唐氏综合症病人和癌症病人或模型动物的体内已发现过量的H2S和/或CBS活性的增强，因此，hCBS（human CBS）已经被认为是治疗循环休克、中风、唐氏综合症以及肿瘤等与H2S相关的疾病的潜在靶标。已知的hCBS小分子抑制剂，不仅与酶的结合力弱而且选择性也很低，因为他们对其它维生素B6-依赖型酶也有抑制作用。因此，急需筛选出特异性的hCBS抑制剂，可作为“工具药”去证实已发现的H2S的生物学效应和信号通路作用，同时也可作为药物研发的先导化合物。目前，酶抑制剂的发现主要通过两种方法，即生物筛选和合理药物设计。基于靶点的合理药物设计就是通过对药物作用的靶点进行研究，找到新的、合适的药物来治疗某些疾病。发现一个的靶点往往就能设计出一类新药，在新药研究领域也是极受重视的。深入认识酶结构，特别是当它与特异性抑制剂复合时的结构，将会产生一种鉴定该酶中结合位点的方法，并获得酶/抑制剂复合物以及该酶中敏感残基的构象，这些知识对药物设计和优化方法来讲都是至关重要的。hCBS纯酶3D晶体结构已被报道，这为其靶向抑制剂的设计提供了一定的结构基础，但是与底物-结合相关的氨基酸残基还不清楚。因此，本领域的技术人员致力于研究hCBS酶促反应的抑制剂以及这种抑制剂作为研究治疗循环休克、中风、唐氏综合症和肿瘤等与H2S相关的疾病的药物的先导化合物的应用。
技术实现思路
本专利技术中所用缩写如下：hCBS指人源胱硫醚-β-合成酶，即human cystathionineβ-synthase；DTNB指5,5'-二硫代二（2-硝基苯甲酸），即5,5'-Dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)；Tris-HCl指三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，即Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride；EDTA指乙二胺四乙酸，即Ethylene Diamine Tetraacetic Acid；L-Cys指L-半胱氨酸，即L-Cysteine；D,L-HCys指D,L-同型半胱氨酸，即D,L-Homocysteine；SAM指S-腺苷甲硫氨酸，即S-adenosyl methionine；PLP指磷酸吡哆醛，即pyridoxal-5’-phosphate；HepG2细胞指人肝癌细胞株，即a human liver carcinoma cell line；本专利技术中用Compd.3指代喹哪啶蓝。本专利技术中所提到的酶促反应容器能够容纳H2S气体检测容器，即气体检测容器能够置入酶促反应容器中，以使酶促反应产生的H2S气体能够全部扩散进入检测体系。本专利技术公开了一种喹哪啶类化合物作为hCBS酶抑制剂的应用，该类化合物是喹哪啶蓝，结构如式（Ⅰ）所示，分子量191.19：本专利技术公开了一种抑制离体hCBS酶促反应的方法，其应用步骤如下：步骤一、配制缓冲溶液：在酶促反应容器中配置Tris-HCl浓度为50mM，PLP浓度为100μM，hCBS-413浓度为50-500nM，L-Cys浓度为4mM，D,L-HCys浓度为4mM的去离子水溶液，pH为7.6-9.0；步骤二、配制酶促反应混合液：将化合物喹哪啶蓝分别加入到步骤一所配制的缓冲溶液中，配制成不同浓度的酶促反应混合液，形成酶促反应体系；步骤三、配制H2S气体检测体系：在H2S气体检测容器中，加入50μL的DTNB溶液，所述DTNB溶液为：DTNB浓度为300μM，Tris-HCl浓度为262mM，EDTA浓度为13mM，pH=8.9的去离子水溶液，形成H2S气体检测体系；将气体检测容器置入酶促反应容器中，以使酶促反应产生的H2S气体能够扩散进入气体检测体系；步骤四、孵育过程：用封板膜密封酶促反应容器，在37℃下孵育60分钟；步骤五、化合物喹哪啶蓝作为hCBS抑制剂应用效果的检测：在酶标仪上测定H2S气体检测体系在413nm下的光吸收。优选地，上述抑制hCBS酶促反应的方法，其中，步骤一中所述pH=8.6。优选地，上述抑制hCBS酶促反应的方法，其中，步骤一中所述hCBS-413浓度为100nM。优选地，上述抑制hCBS酶促反应的方法，其中，步骤二中所述化合物喹哪啶蓝的浓度为0-400μM。优选地，上述抑制hCBS酶促反应的方法，其中，步骤二中所述化合物喹哪啶蓝的浓度为20μM。另一方面，本专利技术公开了化合物喹哪啶蓝作为细胞内hCBS酶抑制剂的应用，其步骤如下：步骤一、将人源HepG2培养在氨基酸营养液中孵育一天后，将化合物喹哪啶蓝加入到所述氨基酸营养液中，进行共孵育；然后，用冷的Tris-HCl缓冲液将细胞洗涤两次，并用细胞刮刷收集。收集的细胞在裂解缓冲液中，先用液氮冷冻，然后在37℃下解冻2分钟，此冷冻、解冻操作重复3次。之后，裂解液在转离心机上离心1小时后，收集上层清液。作为HepG2细胞溶液进行下一步实验；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH=8.6；步骤二、酶促反应容器中加入步骤一中得到的HepG2细胞溶液，然后加入PLP浓度为100μM、SAM浓度为200μM的去离子水溶液20μL和L-Cys浓度为4mM、D,L-HCys浓度为4mM的去离子水溶液，形成细胞内酶促反应体系；步骤三、配制H2S气体检测体系：在H2S气体检测容器中，加入50μL的DTNB溶液，所述DTNB溶液为：DTNB浓度为300μM，Tris-HCl浓度为262mM，EDTA浓度为13mM，pH=8.9的去离子水溶液，形成H2S气体检测体系；将气体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种喹哪啶类化合物作为hCBS酶抑制剂的应用，该化合物是喹哪啶蓝，结构如式（Ⅰ）所示，分子量191.19：
【技术特征摘要】
1.一种喹哪啶类化合物作为hCBS酶抑制剂的应用，该化合物是喹哪啶蓝，
结构如式（Ⅰ）所示，分子量191.19：
2.一种抑制离体hCBS酶的方法，其步骤如下：
步骤一、配制缓冲溶液：在酶促反应容器中配置Tris-HCl浓度为50mM，
PLP浓度为100μM，hCBS-413浓度为50-500nM，L-Cys浓度为4mM，D,L-HCys
浓度为4mM的去离子水溶液，pH为7.6-9.0；
步骤二、配制酶促反应混合液：将化合物喹哪啶蓝分别加入到步骤一所配
制的缓冲溶液中，配制成不同浓度的酶促反应混合液，形成酶促反应体系；
步骤三、配制H2S气体检测体系：
在H2S气体检测容器中，加入50μL的DTNB溶液，所述DTNB溶液为：
DTNB浓度为300μM，Tris-HCl浓度为262mM，EDTA浓度为13mM，pH=8.9
的去离子水溶液，形成H2S气体检测体系，将气体检测容器置入酶促反应容器
中，以使酶促反应产生的H2S气体能够扩散进入气体检测体系；
步骤四、孵育过程：
用封板膜密封酶促反应容器，在37℃下孵育60分钟；
步骤五、化合物喹哪啶蓝作为hCBS抑制剂应用效果的检测：
在酶标仪上测定H2S气体检测体系在413nm下的光吸收。
3.如权利要求2所述的方法，其中，步骤一中所述pH=8.6。
4.如权利要求2所述的方法，其中，步骤一中所述hCBS-413浓度为100nM。
5.如权利要求2所述的方法，其中，步骤二中所述化合物喹哪啶蓝的浓度
为0-400μM。
6.如权利要求2所述的方法，其中，步骤二中所述化合物喹哪啶蓝的浓度
为20μM。
7.一种抑制细胞内hCBS酶活性的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：周越洋，于晶，吴方，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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