用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组、试剂盒、文库及应用制造技术

本发明专利技术涉及生化检测领域，具体涉及一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组、试剂盒、文库及应用。所述的用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组，可在同一PCR反应体系中对14个致癌基因APC、AKT1、BRAF、CTNNB1、EGFR、FBXW7、KRAS、NRAS、PIK3CA、PPP2R1A、PTEN、TP53、BRCA1、BRCA2进行特异性扩增；本发明专利技术还提供了一种包含上述引物组的试剂盒，该试剂盒基于多重PCR靶向捕获技术，可以在8h内轻松地完成目标序列的富集，获得可以直接上机测序的高质量文库。利用上述试剂盒建构建好的测序文库，结合二代测序技术，可以检测到1％甚至更低频率的变异，同时假阳性率极低。

Primers, kits, libraries and applications for combined detection of gynecological tumors with multiple genes

The invention relates to the field of biochemical detection, in particular to a primer group, a kit, a library and an application for the joint detection of gynecological tumors by multiple genes. The primers used for joint detection of gynecological tumors can specifically amplify 14 oncogenes APC, AKT1, BRAF, CTNB1, EGFR, FBXW7, KRAS, NRAS, PIK3CA, PPP2R1A, PTEN, TP53, BRCA1 and BRCA2 in the same PCR reaction system. The kit also provides a kit containing the primers mentioned above, which is based on multiple PCR targeting capture technology. The target sequence can be enriched easily within 8 hours, and a high quality library can be directly sequenced on the computer. Using the above kit to construct the sequencing library, combined with the second generation sequencing technology, we can detect 1% or even lower frequency variation, and the false positive rate is very low.

【技术实现步骤摘要】
用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组、试剂盒、文库及应用
本专利技术涉及生化检测领域，具体涉及一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组、试剂盒、文库及应用。
技术介绍
中国女性生殖道恶性肿瘤发病率居于女性恶性肿瘤的首位，是妇癌患者死亡的主要原因之一，造成妇癌患者死亡率居高不下的主要原因是缺乏早期筛查方法，尤其是卵巢癌。因此，寻求一种早期、简便、特异、无创的筛查方法是改善妇科恶性肿瘤患者预后的亟待解决的重要问题。早期筛查方法的建立可使妇癌患者得以早发现、早诊断、早治疗，使患者生存率提高、死亡率降低，从而达到推动女性生殖道恶性肿瘤预防控制的目标。此外，特异性基因筛查也可作为治疗后的监测指标预测恶性肿瘤的复发，为判断预后及制定个性化治疗方案提供理论依据。高通量基因组技术(如微阵列，二代测序技术)的发展为我们实现这个目标提供可能。2012年美国癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)显示了卵巢癌全基因图谱，发现卵巢癌普遍存在高比率的p53、PI3K、KRAS和B-RAF突变。对子宫内膜癌的基因分析也有类似的发现。这些癌症的共同遗传特征提供了一个对宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌进行早期癌症诊断的机会。根据已发表的子宫内膜癌和卵巢癌的数据，大约12～14个基因可以代表这两种癌症共有致癌基因，包括：APC、AKT1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CTNNB1、EGFR、FBXW7、KRAS、NRAS、PIK3CA、PPP2R1A、PTEN、TP53。与常规液基细胞学异常细胞相比，这些致癌基因突变是肿瘤克隆的特异性标志物，并且在非肿瘤正常细胞中缺乏，而且现有的分子生物学方法可以对宫颈细胞标本中癌细胞进行高敏感性和特异性检测。随着高通量测序技术的日益成熟，基因检测用于精准医疗越来越成为共识，但临床应用要求基因检测周期短、检测成本低和检测准确性高等条件。靶向测序可以解决基因检测周期短(由于只检测目标区域，因此数据分析周期大大缩短)的问题，同时在一定程度上降低测序成本，因此靶向测序是临床应用的一个趋势。靶向测序有两种较为成熟的方法，其一是液相杂交捕获技术，该技术成熟、稳定，但往往建库周期较长(3天左右)，需要较多的贵重仪器(例如打断仪器等)，建库实验成本难以降低等，因此不利于临床推广；靶向测序另一方法是多重PCR捕获技术，其优点是建库实验快、周期短(1天)、不需要额外的设备及检测成本低的优势，便于在实验室开展。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组。本专利技术的另一目的在于提供一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的试剂盒，该试剂盒包括上述用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组。本专利技术的再一目的在于提供一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的二代测序DNA文库。本专利技术的第四个目的在于提供上述用于多基因联合检测妇科肿瘤的二代测序DNA文库的构建方法。本专利技术的第五个目的在于提供上述用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组、试剂盒和二代测序DNA文库的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组，包括AKT1基因引物组、APC基因引物组、BRAF基因引物组、CTNNB1基因引物组、EGFR基因引物组、FBXW7基因引物组、KRAS基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、PPP2R1A基因引物组、PTEN基因引物组、TP53基因引物组、BRCA1基因引物组和BRCA2基因引物组；所述的AKT1基因引物组包括1对引物，所述的AKT1基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.1～2所示；所述的APC基因引物组包括5对引物，所述的APC基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.3～12所示；所述的BRAF基因引物组基因引物组包括1对引物，所述的BRAF基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.13～14所示；所述的CTNNB1基因引物组基因引物组包括1对引物，所述的CTNNB1基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.15～16所示；所述的EGFR基因引物组包括4对引物，所述的EGFR基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.17～24所示；所述的FBXW7基因引物组包括6对引物，所述的FBXW7基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.25～36所示；所述的KRAS基因引物组包括3对引物，所述的KRAS基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.37～42所示；所述的NRAS基因引物组包括2对引物，所述的NRAS基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.43～46所示；所述的PIK3CA基因引物组包括4对引物，所述的PIK3CA基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.47～54所示；所述的PPP2R1A基因引物组包括1对引物，所述的PPP2R1A基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.55～56所示；所述的PTEN基因引物组包括7对引物，所述的PTEN基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.57～70所示；所述的TP53基因引物组包括11对引物，所述的TP53基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.71～92所示；所述的BRCA1基因引物组包括1对引物，所述的BRCA1基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.93～94所示；所述的BRCA2基因引物组包括1对引物，所述的BRCA2基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.95～96所示；一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的试剂盒，包含上述用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组；所述的用于多基因联合检测妇科肿瘤的试剂盒，具体包含如下组分：PCR扩增模块和磁珠纯化模块；所述的PCR扩增模块包含如下组分：2×KAPAHiFiHotStartReadyMix、2.5uMpre-LM-PCRIndex、2.5uMpre-LM-PCROligoPE-1.0和上述用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组；所述的pre-LM-PCRIndex的核酸序列如SEQIDNO.97所示；所述的pre-LM-PCROligoPE-1.0的核酸序列如SEQIDNO.98所示；所述的用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组中各引物的浓度优选为4nmol；所述的磁珠纯化模块包含Magneticbeads和ddH2O；所述的PCR扩增模块优选包含如下组分：所述的磁珠纯化模块优选包含如下组分：Magneticbeads90μL/样本；ddH2O100μL/样本；一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的二代测序DNA文库，利用上述试剂盒构建得到；所述的用于多基因联合检测妇科肿瘤的二代测序DNA文库的构建方法，包含如下步骤：(1)以待测样品的基因组DNA为模板，利用上述试剂盒配制多重PCR扩增反应体系，进行多重PCR扩增，通过多重PCR对目标基因进行特异性捕获扩增，得到第一轮PCR反应产物；其中，多重PCR扩增反应体系包含如下组分：2×KAPAHiFiHotstartReadyMix25μL；用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组8μL；浓度为50ng/μL的基因组DNA1μL；ddH2O16μL；(2)以第一轮PCR反应产物为模板，配制第二轮PCR扩增反应体系，进行第二轮PCR扩增，通过第二轮PCR对不同样本加上测序接头和分子标签，以达到区分不同样本的目的，得到第二轮PCR产物；其中，第二轮PCR扩增反应体系包含如下组分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组，其特征在于：包括AKT1基因引物组、APC基因引物组、BRAF基因引物组、CTNNB1基因引物组、EGFR基因引物组、FBXW7基因引物组、KRAS基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、PPP2R1A基因引物组、PTEN基因引物组、TP53基因引物组、BRCA1基因引物组和BRCA2基因引物组；所述的AKT1基因引物组包括1对引物，所述的AKT1基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；所述的APC基因引物组包括5对引物，所述的APC基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.3～12所示；所述的BRAF基因引物组基因引物组包括1对引物，所述的BRAF基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.13～14所示；所述的CTNNB1基因引物组基因引物组包括1对引物，所述的CTNNB1基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.15～16所示；所述的EGFR基因引物组包括4对引物，所述的EGFR基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.17～24所示；所述的FBXW7基因引物组包括6对引物，所述的FBXW7基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.25～36所示；所述的KRAS基因引物组包括3对引物，所述的KRAS基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.37～42所示；所述的NRAS基因引物组包括2对引物，所述的NRAS基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.43～46所示；所述的PIK3CA基因引物组包括4对引物，所述的PIK3CA基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.47～54所示；所述的PPP2R1A基因引物组包括1对引物，所述的PPP2R1A基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.55～56所示；所述的PTEN基因引物组包括7对引物，所述的PTEN基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.57～70所示；所述的TP53基因引物组包括11对引物，所述的TP53基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.71～92所示；所述的BRCA1基因引物组包括1对引物，所述的BRCA1基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.93～94所示；所述的BRCA2基因引物组包括1对引物，所述的BRCA2基因引物组的核酸序列如SEQ ID NO.95～96所示。...

【技术特征摘要】
1.一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组，其特征在于：包括AKT1基因引物组、APC基因引物组、BRAF基因引物组、CTNNB1基因引物组、EGFR基因引物组、FBXW7基因引物组、KRAS基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、PPP2R1A基因引物组、PTEN基因引物组、TP53基因引物组、BRCA1基因引物组和BRCA2基因引物组；所述的AKT1基因引物组包括1对引物，所述的AKT1基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.1～2所示；所述的APC基因引物组包括5对引物，所述的APC基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.3～12所示；所述的BRAF基因引物组基因引物组包括1对引物，所述的BRAF基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.13～14所示；所述的CTNNB1基因引物组基因引物组包括1对引物，所述的CTNNB1基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.15～16所示；所述的EGFR基因引物组包括4对引物，所述的EGFR基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.17～24所示；所述的FBXW7基因引物组包括6对引物，所述的FBXW7基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.25～36所示；所述的KRAS基因引物组包括3对引物，所述的KRAS基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.37～42所示；所述的NRAS基因引物组包括2对引物，所述的NRAS基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.43～46所示；所述的PIK3CA基因引物组包括4对引物，所述的PIK3CA基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.47～54所示；所述的PPP2R1A基因引物组包括1对引物，所述的PPP2R1A基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.55～56所示；所述的PTEN基因引物组包括7对引物，所述的PTEN基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.57～70所示；所述的TP53基因引物组包括11对引物，所述的TP53基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.71～92所示；所述的BRCA1基因引物组包括1对引物，所述的BRCA1基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.93～94所示；所述的BRCA2基因引物组包括1对引物，所述的BRCA2基因引物组的核酸序列如SEQIDNO.95～96所示。2.一种用于多基因联合检测妇科肿瘤的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组。3.根据权利要求2所述的用于多基因联合检测妇科肿瘤的试剂盒，其特征在于具体包含如下组分：PCR扩增模块和磁珠纯化模块；所述的PCR扩增模块包含如下组分：2×KAPAHiFiHotStartReadyMix、2.5uMpre-LM-PCRIndex、2.5uMpre-LM-PCROligoPE-1.0和权利要求1所述的用于多基因联合检测妇科肿瘤的引物组；所述的pre-LM-PCRIndex的核酸序列如SEQIDNO.97所示；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，陆国辉，
申请(专利权)人：张巍，
类型：发明
国别省市：广东,44