一种用于诊断PRCC-MITF易位性肾癌的探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于诊断PRCC‑MITF易位性肾癌的探针组合及其应用。一种用于诊断PRCC‑MITF易位性肾癌的探针组合，该组合为BAC克隆探针RP11‑867E4和BAC克隆探针RP11‑963H1。其中RP11‑867E4定位于PRCC着丝粒一侧，标记为任意一种颜色的荧光；RP11‑963H1定位于MITF端粒一侧，标记为与PRCC着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光。本发明专利技术所述的探针在制备MITF易位性肾癌诊断试剂中的应用。该探针组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％。

A Probe Combination for the Diagnosis of PRCC-MITF Translocation Renal Carcinoma and Its Application

The invention discloses a probe combination for diagnosing PRCC MITF translocation renal cell carcinoma and its application. A probe combination for the diagnosis of PRCC MITF translocation renal cell carcinoma is composed of BAC cloning probe RP11 867E4 and BAC cloning probe RP11 963H1. RP11 867E4 was located on the side of PRCC centromere and labeled as fluorescence of any color; RP11 963H1 was located on the side of MITF telomere and labeled as fluorescence with different color from that of PRCC centromere. The probe of the invention is applied in the preparation of diagnostic reagent for MITF translocation renal cancer. The specificity and sensitivity of the probe combination diagnosis reached 100%.

【技术实现步骤摘要】
一种用于诊断PRCC-MITF易位性肾癌的探针组合及其应用
本专利技术属于荧光原位杂交探针应用领域，涉及一种用于诊断PRCC-MITF易位性肾癌的荧光原位杂交(FISH)融合基因探针组合及其在制备PRCC-MITF易位性肾癌诊断试剂中的应用。
技术介绍
2016年新版WHO肾脏肿瘤病理组织学分类新增了一种肾细胞癌类型：MiT家族易位性肾细胞癌。MiT家族是小眼畸形转录因子家族(microphthalmia-associatedtranscriptionfactorfamily)的缩写，该家族成员包括MITF，TFE3、TFEB和TFEC基因。目前已经发现的MiT家族易位性肾细胞癌包括Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾细胞癌和t(6；11)(p21；q12)易位/TFEB基因融合相关性肾癌。MITF和TFEC基因易位的肿瘤在世界范围内暂无文献报道。MiT家族易位性肾细胞癌致病机理清晰明确，MiT家族成员基因(TFE3/TFEB)的易位是其关键致病因素：这类肿瘤均涉及MiT家族成员基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFE3/TFEB融合蛋白，而TFE3/TFEB作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前至少有10种不同的易位伴侣和融合基因被报道，包括ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、NONO-TFE3、CLTC-TFE3、LUC7L3-TFE3、KHSRP-TFE3、PARP14-TFE3、DVL2-TFE3、RBM10-TFE3和MALAT1-TFEB等，每例肿瘤内仅存在单一的易位形式。MiT家族易位性肾细胞癌是一罕见类型肿瘤，TFE3基因易位性肾癌约占所有肾细胞癌的1.6％-4％，TFEB基因易位性肾癌相对更加罕见。但该疾病以发病年龄轻为突出特征，占儿童肾细胞癌的40％，且造成极其沉重的家庭及社会负担。此外，有明确证据表明MiT家族易位性肾细胞癌的患者对血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR)或哺乳动物雷帕霉素(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)分子靶向治疗敏感。另有研究表明，MET酪氨酸激酶为ASPL-TFE3融合基因的靶基因，并有望成为TFE3易位性肿瘤的治疗靶点。因此，精确诊断此类肿瘤显得十分重要。本专利技术团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合MiT家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出PRCC-MITF融合基因，该融合基因型为首次发现，国内外均无报道，且这是国际首次发现MITF基因易位相关性肾细胞癌。由于以往没有针对该基因易位的检测手段，可以猜想，以往的MITF基因易位相关性肾细胞癌都被误诊或漏诊了。目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。染色体荧光原位杂交(FISH)始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。此外，FISH的方法，可以在石蜡包埋的样本上进行回顾性研究，大大降低了对研究样本的要求。目前，利用荧光原位杂交(FISH)检测PRCC-MITF融合基因的方法国内外均无报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术问题提供一种用于诊断MITF易位性肾癌的探针组合。本专利技术另一个目的是提供上述探针组合在制备MITF易位性肾癌诊断试剂中的应用。本专利技术再一个目的是提供含有上述探针组合的诊断试剂盒。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：本专利技术团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合MiT家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出PRCC-MITF融合基因,发现该基因由PRCC外显子5和MITF外显子4融合形成。MITF、PRCC基因序列来自GeneBank，序列版本号GRCh38.p7,PRCCtranscript_id＝"XM_005245313.1",MITFtranscript_id＝"NM_198159.2""。本专利技术针对该MiT家族易位性肾细胞癌的新融合基因设计了诊断PRCC-MITF易位性肾癌的探针组合。一种用于诊断PRCC-MITF易位性肾癌的探针组合，该组合为BAC克隆探针RP11-867E4和BAC克隆探针RP11-963H1。所述的探针组合，其中，BAC克隆探针RP11-867E4定位于PRCC着丝粒一侧，标记为任意一种颜色的荧光；BAC克隆探针RP11-963H1定位于MITF端粒一侧，标记为与PRCC着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光。所述的探针组合，其中RP11-867E4优选标记为绿色荧光，RP11-963H1优选标记为红色荧光；标记的荧光颜色可以互换。本专利技术所述的探针在制备MITF易位性肾癌诊断试剂中的应用。一种MITF易位性肾癌诊断试剂盒，包含本专利技术所述的探针组合。以下是本专利技术技术方案详细的说明：本专利技术采用的探针组合为国内外首次利用FISH方法检测PRCC-MITF融合基因，是基于对染色体上PRCC基因着丝粒侧和MITF基因端粒侧的不同的BAC克隆探针结合位点的分布位置、大小等情况的分析而采取的优选方案。本专利技术中，PRCC着丝粒一侧BAC克隆探针为RP11-867E4(片段长度222kb)，MITF端粒一侧BAC克隆探针为RP11-963H1(片段长度196kb)，这些片段为细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome，BAC)克隆，其在人类染色体上的定位已经公开，分别为，RP11-867E4定位于1号染色体156414562–156636320，RP11-963H1定位于3号染色体70151790-70348243。PRCC基因的定位为1号染色体156737274-156770609。MITF基因的定位为3号染色体69788586-70017488。BAC克隆探针与PRCC基因的链接顺序为PRCC，RP11-867E4，1号染色体着丝粒；BAC克隆探针与MITF基因的链接顺序为3号染色体着丝粒，MITF，RP11-963H1。BAC克隆探针与染色体上相应位置的序列结合而标记上荧光，片段位置与PRCC、MITF基因之间保持一定距离而不重叠(本专利技术中距离最大为134kb，最小为101kb)，因而PRCC、MITF基因内部的断裂重排不会影响BAC克隆片段与染色体相应位置结合。此外，MITF基因端粒侧和PRCC基因着丝粒侧BAC克隆探针最远距离控制在1500kb之内。这样，在非MITF易位性肾癌不存在PRCC-MITF融合基因时，红绿两种荧光离得比较远，观察时无需放大即可见到分离较远的红绿两种信号；当MITF易位性肾癌存在PRCC-MITF融合基因时，红绿两种荧光靠得比较近，观察时出现红绿融合信号(表现为红绿相连或黄色信号点)，很容易观察。选择这2种BAC克隆探针有以下几个方面的考虑：①2个BAC克隆探针大小相近，带来的好处是：每一端的荧光强度保持一致，防止一端过强本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于诊断PRCC‑MITF易位性肾癌的探针组合，其特征在于由BAC克隆探针RP11‑867E4和BAC克隆探针RP11‑963H1组成。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断PRCC-MITF易位性肾癌的探针组合，其特征在于由BAC克隆探针RP11-867E4和BAC克隆探针RP11-963H1组成。2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于所述的BAC克隆探针RP11-867E4定位于PRCC着丝粒一侧，标记为任意一种颜色的荧光；所述的BAC克隆探针RP11-963H1定位于MITF端粒一侧，标记为与PRCC着丝粒一侧标记的...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏秋媛，饶秋，李锐，王小桐，李芳秋，周晓军，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区南京总医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32