一种糖基转移酶突变体制造技术

本发明专利技术通过定向进化的方法获得了酶活力提高的糖基转移酶突变体SEQ ID NOs:3‑6，这些突变体或者其表达微生物能高效催化原人参二醇通过糖基转移反应来制备人参皂苷CK，具有工业化开发和应用前景。

A Glycosyltransferase Mutant

The present invention obtains glycosyltransferase mutants SEQ ID NOs:3 6 with enhanced enzyme activity by directional evolution method. These mutants or their expressing microorganisms can efficiently catalyze protopanaxadiol to prepare ginsenoside CK through glycosyltransferring reaction, which has industrial development and application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种糖基转移酶突变体
本专利技术属于生物催化领域，具体地说，涉及一种糖基转移酶突变体及其在合成人参皂苷CK中的用途。
技术介绍
人参皂苷是从人参及其同属植物(如三七、西洋参等)中分离到的皂苷的总称，属于三萜类皂苷，是人参中的主要有效成份。目前，已经从人参中分离出了至少60种皂苷，其中一些人参皂苷被证实具有广泛的生理功能和药用价值：包括抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、护心、护肝等功能。根据苷元配基的形式，人参皂苷通常被分为三类，齐墩果烷型，原人参二醇型(PPD型)和原人参三醇型(PPT型)。其中，如下式I所示的人参皂苷compoundK(CK)是PPD型人参皂苷最具生物和药学活性的成分。人参皂苷CK具有很好的抗肿瘤活性，可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移。它与放疗和化疗结合试验，可以增强放疗和化疗的效果。除此之外，人参皂苷CK还有具有抗过敏活性，抗炎活性，并且可以起到神经保护作用，抗糖尿病作用和抗皮肤衰老作用。人参皂苷CK的药理活性具有多靶点、高活性和低毒性的特点。一直以来人参皂苷类化合物主要来源是通过植物人参中直接提取，由于人参生长周期长、生长环境要求苛刻，无法满足社会需求。目前已可通过酶催化或微生物工程菌发酵合成人参皂苷化合物，但产量较低，有待更多的优化工作提高发酵产量。人参皂苷CK在人参中含量极低，它是原人参二醇型皂苷(PPD型)在人体肠道中被微生物水解后产生的主要代谢产物。研究表明，多数原人参二醇型皂苷只有被代谢为CK后才能被人体吸收，所以人参皂苷CK是直接被体内吸收和发挥作用的真正实体，而其他皂苷只是药物前体。原人参二醇(PPD)在UDP糖基转移酶(尿苷5’-二磷酸葡萄糖基转移酶，UGT)的作用下可生成CK。因此开发特异性高、酶活力高的糖基转移酶成为一种生产人参皂苷CK的有效途径。
技术实现思路
为了开发催化效率高的UDP糖基转移酶(UGT)，本专利技术以人参Panaxginseng来源的尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶UGT1(GenBank:AIE12479.1，即SEQIDNO:1)为基础，通过易错PCR的方法建立糖基转移酶基因突变库，再通过筛选基因突变库获得酶活力明显提高的糖基转移酶突变体。因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种糖基转移酶，其氨基酸序列为：SEQIDNO:3，其为SEQIDNO:1第82位的H替换为A、第175位的S替换为A的突变体，即：MKSELIFLPAPAIGHLVGMVEMAKLFISRHENLSVTVLIAKFYMDTGVDNYNKSLLTNPTPRLTIVNLPETDPQNYMLKPRAAIFPSVIETQKTHVRDIISGMTQSESTQVVGLLADLLFINIMDIANEFNVPTYVYSPAGAGHLGLAFHLQTLNDKKQDVTEFRNSDTELLVPAFANPVPAEVLPSMYVDKEGGYDYLFSLFRRCRESKAIIINTFEELEPYAINSLRMDSMIPPIYPVGPILNLNGDGQNSDEAAVILGWLDDQPPSSVVFLCFGSYGSFQENQVKEIAMGLERSGHRFLWSLRPSIPKGETKLQLKYSNLKEILPVGFLDRTSCVGKVIGWAPQVAVLGHESVGGFLSHCGWNSTLESVWCGVPVATWPMYGEQQLNAFEMVKELGIAVEIEVDYKKDYFNMKNDFIVRAEEIETKIKKLMMDENNSEIRKKVKEMKEKSRAAMSENGSSYNSLAKLFEEIM(SEQIDNO:3)；SEQIDNO:4，其为SEQIDNO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T的突变体，即：MKSELIFLPAPAIGHLVGMVEMAKLFISRHENLSVTVLIAKFYMDTGVDNYNKSLLTNPTPRLTIVNLPETDPQNYMLKPRAAIFPSAIETQKTHVRDIISGMTQSESTQVVGLLADLLFIKIMDIANTFNVPTYVYSPAGAGHLGLAFHLQTLNDKKQDVTEFRNSDTELLVPSFANPVPAEVLPSMYVDKEGGYDYLFSLFRRCRESKAIIINTFEELEPYAINSLRMDSMIPPIYPVGPILNLNGDGQNSDEAAVILGWLDDQPPSSVVFLCFGSYGSFQENQVKEIAMGLERSGHRFLWSLRPSIPKGETKLQLKYSNLKEILPVGFLDRTSCVGKVIGWAPQVAVLGHESVGGFLSHCGWNSTLESVWCGVPVATWPMYGEQQLNAFEMVKELGIAVEIEVDYKKDYFNMKNDFIVRAEEIETKIKKLMMDENNSEIRKKVKEMKEKSRAAMSENGSSYNSLAKLFEEIM(SEQIDNO:4)；SEQIDNO:5，其为SEQIDNO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T、第315位的K替换为D的突变体，即：MKSELIFLPAPAIGHLVGMVEMAKLFISRHENLSVTVLIAKFYMDTGVDNYNKSLLTNPTPRLTIVNLPETDPQNYMLKPRAAIFPSAIETQKTHVRDIISGMTQSESTQVVGLLADLLFIKIMDIANTFNVPTYVYSPAGAGHLGLAFHLQTLNDKKQDVTEFRNSDTELLVPSFANPVPAEVLPSMYVDKEGGYDYLFSLFRRCRESKAIIINTFEELEPYAINSLRMDSMIPPIYPVGPILNLNGDGQNSDEAAVILGWLDDQPPSSVVFLCFGSYGSFQENQVKEIAMGLERSGHRFLWSLRPSIPKGETDLQLKYSNLKEILPVGFLDRTSCVGKVIGWAPQVAVLGHESVGGFLSHCGWNSTLESVWCGVPVATWPMYGEQQLNAFEMVKELGIAVEIEVDYKKDYFNMKNDFIVRAEEIETKIKKLMMDENNSEIRKKVKEMKEKSRAAMSENGSSYNSLAKLFEEIM(SEQIDNO:5)；或者SEQIDNO:6，其为SEQIDNO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T、第175位的S替换为A的突变体，即：MKSELIFLPAPAIGHLVGMVEMAKLFISRHENLSVTVLIAKFYMDTGVDNYNKSLLTNPTPRLTIVNLPETDPQNYMLKPRAAIFPSAIETQKTHVRDIISGMTQSESTQVVGLLADLLFIKIMDIANTFNVPTYVYSPAGAGHLGLAFHLQTLNDKKQDVTEFRNSDTELLVPAFANPVPAEVLPSMYVDKEGGYDYLFSLFRRCRESKAIIINTFEELEPYAINSLRMDSMIPPIYPVGPILNLNGDGQNSDEAAVILGWLDDQPPSSVVFLCFGSYGSFQENQVKEIAMGLERSG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糖基转移酶，其氨基酸序列为：SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第82位的H替换为A、第175位的S替换为A的突变体；SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T的突变体；SEQ ID NO:5，其为SEQ ID NO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T、第315位的K替换为D的突变体；或者SEQ ID NO:6，其为SEQ ID NO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T、第175位的S替换为A的突变体。

【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶，其氨基酸序列为：SEQIDNO:3，其为SEQIDNO:1第82位的H替换为A、第175位的S替换为A的突变体；SEQIDNO:4，其为SEQIDNO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T的突变体；SEQIDNO:5，其为SEQIDNO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T、第315位的K替换为D的突变体；或者SEQIDNO:6，其为SEQIDNO:1第82位的H替换为A、第88位的V替换为A、第122位的N替换为K、第129位的E替换为T、第175位的S替换为A的突变体...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，高书良，王金刚，梁岩，袁圣伦，任亮，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33