一种类黄酮异戊烯基转移酶基因及其用途制造技术

本发明专利技术公开的一种类黄酮异戊烯基转移酶基因，该类黄酮异戊烯基转移酶基因即为从豆科植物白羽扇豆中鉴定的LaPT2，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。并且，本发明专利技术公开了该基因的用途，其编码的蛋白可用于产生多种异戊烯基化的类黄酮化合物。本发明专利技术的优点在于，本发明专利技术从豆科植物白羽扇豆中克隆出类黄酮异戊烯基转移酶基因，并对其功能进行了系统鉴定，发现了该基因可以在体外异源产生多种具有生物活性的异戊烯基化的类黄酮化合物。

A Flavonoid Isopentenyl Transferase Gene and Its Application

The invention discloses a flavonoid isoprenyl transferase gene, which is LaPT2 identified from white lupin of leguminous plant. Its gene sequence is shown as SEQ ID NO.1, and its encoded protein sequence is shown as SEQ ID NO.2. Furthermore, the present invention discloses the use of the gene, and the protein encoded by the gene can be used to produce various isoprenylated flavonoids. The invention has the advantages that the flavonoid isoprenyltransferase gene is cloned from white lupin, a leguminous plant, and its function is systematically identified. It is found that the gene can produce various biologically active isoprenyltransferase flavonoids in vitro.

【技术实现步骤摘要】
一种类黄酮异戊烯基转移酶基因及其用途
本专利技术属于基因工程
，具体为一种类黄酮异戊烯基转移酶基因及其用途。
技术介绍
类黄酮是一大类重要的植物次生代谢产物，包括黄酮醇、黄酮、异黄酮等，异戊烯基化是类黄酮的一种主要的修饰方式，异戊烯基化的类黄酮主要存在于豆科植物中，在植物的生长发育中起着重要作用。异戊烯基化的类黄酮具有多种功能，包括抗菌、抗氧化、抗肿瘤，在植物防御中具有明确的抗病菌作用。同时，很多异戊烯基化的类黄酮也是传统中药的重要组成成份，具有促进人体健康的功效。但是，目前植物各种类黄酮异戊烯基化的机制还不完全清楚，鉴于异戊烯基转移酶的多重功能，相对于植物中存在的种类繁多的异戊烯基类黄酮化合物以及其潜在的应用价值，克隆和鉴定具有新功能、底物特异性和生物活性的植物类黄酮异戊烯基转移酶基因具有重要的理论和应用价值。
技术实现思路
为了解决现有技术中类黄酮异戊烯基转移酶基因功能未知、没有活性的问题，本专利技术提供了一种类黄酮异戊烯基转移酶基因及其用途，实现的目的为，本专利技术从豆科植物白羽扇豆中克隆出对多种类黄酮、特别是其中的黄酮醇具有催化活性的异戊烯基转移酶基因，并对其功能进行了鉴定，产生了具有活性的异戊烯基化类黄酮，也为在其它生物中利用生物技术生产异戊烯基化类黄酮提供了重要的基因资源和技术方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为，本专利技术提供的一种类黄酮异戊烯基转移酶基因，该类黄酮异戊烯基转移酶基因即为LaPT2，其基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所发现的LaPT2类黄酮异戊烯基转移酶基因是从白羽扇豆中克隆出来的，是一种全新的类黄酮异戊烯基转移酶基因，丰富了类黄酮异戊烯基转移酶的种类，同时由于异戊烯基化的类黄酮具有增强植物抗病性，进一步帮助实现增强生物，特别是植物本身抗病菌能力在产业上的应用。进一步的，所述该类黄酮异戊烯基转移酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步的，所述类黄酮异戊烯基转移酶基因的用途在其它生物中异源表达可以催化多种类黄酮进行异戊烯基化反应，产生具有生物活性的异戊烯基化类黄酮化合物。山奈酚、槲皮素和杨梅素是自然界含量最丰富的黄酮醇类的类黄酮，本专利技术证明重组的LaPT2蛋白对山奈酚和槲皮素具有很高的催化活性，这是植物中发现的第一个以黄酮醇为特异性底物的类黄酮异戊烯基转移酶基因。本专利技术采用上述技术方案，具有以下有益效果，本专利技术从白羽扇豆克隆出类黄酮异戊烯基转移酶基因，并对其功能进行了系统鉴定，发现了该基因可以在酵母中产生具有活性的重组蛋白，催化多种类黄酮化合物的异戊烯基化反应，特别是类黄酮中的黄酮醇。附图说明图1为本专利技术白羽扇豆类黄酮异戊烯基转移酶与其它植物相关异戊烯基转移酶的进化分析图谱。图2为本专利技术白羽扇豆异戊烯基转移酶与豆科类黄酮异戊烯基转移酶氨基酸序列的比对分析图谱，图中，类黄酮异戊烯基转移酶两个保守的基序NQxxDxxxD和KD(I/L)xDx(E/D)用黑色线框表示。图3为本专利技术白羽扇豆类黄酮异戊烯基转移蛋白在拟南芥原生质体中的亚细胞定位，图中，A共聚焦显微镜下细胞瞬时表达LaPT2-GFP融合蛋白的荧光信号；B共聚焦显微镜下细胞瞬时表达LaPT2-TP87-GFP融合蛋白的荧光信号；C共聚焦显微镜下细胞瞬时表达LaPT2-△TP87-GFP融合蛋白的荧光信号，标尺＝5μm。图4为本专利技术利用HPLC技术鉴定重组蛋白LaPT2的体外酶活产物图谱，图中，A重组蛋白LaPT2酶活反应代表性HPLC色谱图。上一组，底物山奈酚与产物异戊烯基山奈酚色谱图；下一组，底物槲皮素和产物异戊烯基槲皮素色谱图。B重组蛋白LaPT2酶活产物和底物紫外吸收色图谱。上一组，底物山奈酚与产物异戊烯基山奈酚紫外吸收色图谱；下一组，底物槲皮素和产物异戊烯基槲皮素紫外吸收色图谱。图5为在鉴定LaPT2重组蛋白功能时所用的各种类黄酮化合物的化学结构图。图6为利用UPLC-MS技术鉴定重组蛋白LaPT2的其它各种体外酶活产物的质谱图。A-E,分别为异戊烯基化的山奈酚、山奈素、槲皮素、桑色素、高良姜素、漆黄素。图7为本专利技术使用HPLC和UPLC-MS技术分析白羽扇豆叶和根部类黄酮成份质谱图，图中，A白羽扇豆叶和根部甲醇提取物的HPLC色谱图。实箭头表示检测到的黄酮醇类物质，虚箭头表示异黄酮类物质。B白羽扇豆根部异戊烯基山奈酚和山奈酚的质谱图。图8采用qRT-PCR技术分析白羽扇豆中LaPT2基因在叶和根部的相对表达量。具体实施方式以下结合附图对本专利技术做出进一步的说明。实施例一：本专利技术发现的一种类黄酮异戊烯基转移酶基因，记为LaPT2，其基因序列如SEQIDNO.1所示，SEQIDNO.1所示的序列中ATG为起始密码子,TGA为终止密码子，该基因编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其用途为在其它生物中异源表达可以催化多种类黄酮进行异戊烯基化反应，产生具有生物活性的异戊烯基化类黄酮化合物。该基因在白羽扇豆中被鉴定和克隆，以下介绍是如何从白羽扇豆中将该基因克隆，并确定其是一种类黄酮异戊烯基转移酶基因、以及确定其用途的方法：一、材料与方法：1.1植物材料和生长环境白羽扇豆种子用20％次氯酸钠溶液消毒10分钟后根据需要播种于蛭石或营养土中，在16小时光照，8小时黑暗，25℃/23℃环境条件下萌发生长。1.2实验所用载体及菌株大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α，酵母表达载体pDR196GW、亚细胞定位载体pJIT163-hGFP来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所实验室。1.3化学标准品及试剂类黄酮标准品genistein，2'-hydroxygenistein，daidzein，biochaninA，formononetin，apigenin，luteolin，tricetin，kaempferol，kaempferide，quercetin，myricetin，3-hydroxyflavone，naringenin，liquiritigenin和isoliquiritigenin购买自上海同田生物技术股份有限公司；wighteone，fisetin，galangin，morin，astragalin购买自武汉凯米特科技有限公司。DMAPP购买自sigma-aldrich公司。用于配制酵母合成缺陷培养基(SyntheticDrop-out(SD)medium)的各种成份购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.4植物总RNA提取及反转录取白羽扇豆叶片或根材料，用研钵磨碎，然后取适量磨碎样品，用植物RNA提取试剂(Takara，RNAisoPlus(CodeNo.:9108))进行总RNA的提取。具体操作步骤如下：1)取磨碎样品100mg，加入1mLRNAisoPlus，混匀；2)室温静置5分钟，4℃，12000g离心5分钟；3)上清转入新的1.5mL离心管，加入200μL氯仿，振荡混匀；4)室温静置5分钟；4℃，12000g离心15分钟；5)上清液转入新的离心管，加入1倍体积的异丙醇；6)室温静置10分钟；4℃，12000g离心10分钟；7)倒掉上清液，加入1mL75％乙醇清洗沉淀；8)4℃，7500g离心5分钟，弃上清；9)4℃，7500g离心2分钟，吸尽残余溶液；1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类黄酮异戊烯基转移酶基因，其特征在于，该类黄酮异戊烯基转移酶基因记为LaPT2，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种类黄酮异戊烯基转移酶基因，其特征在于，该类黄酮异戊烯基转移酶基因记为LaPT2，其基因序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1的类黄酮异戊烯基转移酶基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞永珍，刘晋跃，夏亚迎，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11