本发明专利技术公开了一种N‑脱氧核糖转移酶II定向进化改造和生物催化应用。本发明专利技术提供了N‑脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)突变体，其为将序列表中序列2所示的氨基酸残基第10位的Gly突变为Ser，且其他氨基酸残基不变，得到的蛋白质。本发明专利技术通过序列比对瑞士乳杆菌来源的NDT(Lh NDT)和莱曼氏乳杆菌来源的NDT(Ll NDT)，同源建模，构建饱和突变体库，高通量筛选600个突变体，获得酶活力提高10.4倍瑞士乳杆菌来源的N‑脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体。本发明专利技术提供的N‑脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体可以高效催化制备抗艾滋病药物扎西他滨。
Directed Evolutionary Modification and Biocatalytic Application of N-Deoxyribosyltransferase II
The invention discloses a directed evolution modification of N deoxyribosyltransferase II and a biocatalytic application. The present invention provides a N deoxyribosyltransferase II (NDT) mutant, which is a protein obtained by mutating Gly at the tenth position of amino acid residue shown in sequence 2 into Ser, while other amino acid residues remain unchanged. By sequence alignment of NDT from Lactobacillus Switzerland and NDT from Lactobacillus Lehmannii, homology modeling, construction of saturated mutant library, high throughput screening of 600 mutants, and acquisition of N deoxyribosyltransferase II mutant from Lactobacillus Switzerland with 10.4 times higher enzyme activity. The mutant of N_deoxyribosyltransferase II provided by the invention can efficiently catalyze the preparation of anti-AIDS drug zacetabine.
【技术实现步骤摘要】
一种N-脱氧核糖转移酶II定向进化改造和生物催化应用
本专利技术属于酶的定向进化改造和生物催化应用
，尤其涉及一种N-脱氧核糖转移酶II定向进化改造和生物催化应用。
技术介绍
核苷类似物在临床上广泛应用于病毒和肿瘤疾病的治疗，目前使用的抗病毒药物中近50％是核苷类药物。如治疗疱疹病毒感染的阿昔洛韦、泛昔洛韦；治疗单纯疱疹及脑炎的阿糖腺苷，治疗丙型肝炎的利巴韦林、索非布韦，治疗艾滋病的HIV逆转录酶抑制剂齐多夫定、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定，新一代抗肿瘤药物地西他滨、吉西他滨、奈拉滨等都属于核苷类药物。其中扎西他滨(Zalcitabine，DDC)，化学名2',3'-二脱氧胞苷，在细胞内转化为有活性的三磷酸代谢物，从而竞争性抑制逆转录酶活性，临床上主要用于艾滋病和艾滋病相关综合症的治疗。目前扎西他滨的制备采用化学合成法，步骤复杂，反应条件苛刻，收率低，生产成本高。N-脱氧核糖转移酶(EC2.4.2.6)可以催化脱氧核糖在不同碱基之间的转移，根据底物特异性的不同可以分为两类：N-脱氧核糖转移酶Ⅰ(NucleosidedeoxyribosyltransferaseⅠ,PDT)，只能催化脱氧核糖在嘌呤之间转移；N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(NucleosidedeoxyribosyltransferaseⅡ,NDT)，催化脱氧核糖在嘌呤和嘧啶之间的转移。NDT碱基识别范围广，可以识别多种天然和经过修饰的碱基，且转化率较高，因此被应用于多种脱氧核苷类似物的合成，如5-氟-2'-脱氧尿苷，6-氯-2'-脱氧胞苷等。但NDT对2'-脱氧核糖结构有高度底物特异性,对于带有糖基修饰的核苷类似物，如阿糖胞苷，司他夫定，吉西他滨和扎西他滨等，催化合成的效率极低，限制了NDT的应用。前期研究发现，瑞士乳杆菌来源的野生型NDT(LhNDT)几乎不能催化2',3'-二脱氧核苷进行反应，如不能催化2',3'-二脱氧肌苷合成扎西他滨。因此需要通过对瑞士乳杆菌来源的野生型NDT定向进化改造，扩大NDT的底物识别范围或者增强对2',3'-二脱氧核苷的特异性，提高酶的活性和催化效率，获得高转化率的NDT。
技术实现思路
本专利技术是针对现有N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)对带有糖基修饰的核苷类似物特别是2',3'-二脱氧核糖类似物催化效率低的问题,提供一种通过定向进化提高酶活力的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体的制备方法与应用。本专利技术一个目的是提供蛋白质。本专利技术提供的蛋白质，为N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)突变体，命名为THNDT，其为将序列表中序列2所示的氨基酸残基第10位的Gly突变为Ser，且其他氨基酸残基不变，得到的蛋白质。在如上蛋白基础上，做出如下变形的蛋白也都属与本专利技术的蛋白的保护范围,如下变形的蛋白为1)或2)或3)：1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；2)在序列表中序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与带有糖基修饰的核苷类似物合成相关的蛋白质；或，所述蛋白质作为N-脱氧核糖转移酶II催化效率高于序列4所示的N-脱氧核糖转移酶II的催化效率。上述中，所述催化效率是指催化2',3'-二脱氧核苷类化合物发生糖基转移反应生成不同碱基2',3'-二脱氧核苷类似物的转化率；DNA是由脱氧核苷酸组成，包括三部分。一个碱基、一个脱氧核糖和一个磷酸，此处脱氧核糖是指2'-脱氧核苷类化合物。2',3'-二脱氧核苷类化合物是指脱氧核糖中另外一个羟基即3'-羟基被H取代，有几种药物是2',3'-二脱氧核苷类化合物，包括扎西他滨。和/或，所述催化效率是指催化底物2',3'-二脱氧肌苷合成扎西他滨的转化率。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码上述蛋白质的核酸分子也是本专利技术保护的范围。上述核酸分子为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：(a1)编码区包括序列表中序列3的DNA分子；(a2)核苷酸序列是序列表中序列3的DNA分子；(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的DNA分子；(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也是本专利技术保护的范围。b1)-b6)中任一种的应用也是本专利技术保护的范围：b1)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物，在催化合成带有糖基修饰的核苷类似物中的应用；b2)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物，在提高催化合成带有糖基修饰的核苷类似物产量中的应用；b3)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物，在催化或识别2',3'-二脱氧核苷中的应用；b4)上述蛋白质，在作为N-脱氧核糖转移酶Ⅱ中的应用；b5)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物，在提高N-脱氧核糖转移酶II催化效率中的应用；b6)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在制备扎西他滨中的应用。上述应用中，所述带有糖基修饰的核苷类似物为2',3'-二脱氧核糖类似物；和/或，所述2',3'-二脱氧核糖类似物为扎西他滨。本专利技术另一个目的是提供一种获得2',3'-二脱氧胞苷的方法，也就是制备抗艾滋病药物扎西他滨的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：用上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物催化2',3'-二脱氧肌苷和胞嘧啶，得到扎西他滨。本专利技术第3个目的是提供一种提高N-脱氧核糖转移酶II催化效率的方法，为将序列表中序列4所示的氨基酸残基为序列表中序列2所示的氨基酸残基，所述序列表中序列2所示的氨基酸残基的N-脱氧核糖转移酶II催化效率高于序列表中序列4所示的氨基酸残基。上述中，所述催化效率是指催化2',3'-二脱氧核苷类化合物发生糖基转移反应生成不同碱基2',3'-二脱氧核苷类似物的转化率；和/或，所述催化效率是指催化底物2',3'-二脱氧肌苷合成扎西他滨的转化率。本专利技术的实验证明，本专利技术构建了瑞士乳杆菌来源的NDT重组工程菌株。通过序列比对，对瑞士乳杆菌来源的NDT(LhNDT)进行同源建模，通过饱和定点突变与高通量筛选，获得瑞士乳杆菌来源的酶活力提高5.2倍的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体。本专利技术提供的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体可以高效催化制备抗艾滋病药物扎西他滨(2',3'-二脱氧胞苷)。利用表达THNDT的全细胞催化2',3'-二脱氧肌苷和胞嘧啶合成2',3'-二脱氧胞苷，通过HPLC检测，仅反应8h转化率达到23.8％，酶活较野生型提高了10.4倍。本专利技术提供N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体THNDT可以用于全细胞催化合成抗艾滋病药物扎西他滨。附图说明图1为N-脱氧核糖转移酶Ⅱ-胞苷脱氨酶偶联显色反应。图2为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.蛋白质，其为将序列表中序列2所示的氨基酸残基第10位的Gly突变为Ser，且其他氨基酸残基不变，得到的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.蛋白质，其为将序列表中序列2所示的氨基酸残基第10位的Gly突变为Ser，且其他氨基酸残基不变，得到的蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下1)或2)或3)：1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；2)在序列表中序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与带有糖基修饰的核苷类似物合成相关的蛋白质；或，所述蛋白质作为N-脱氧核糖转移酶II催化效率高于序列4所示的N-脱氧核糖转移酶II的催化效率。3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：(a1)编码区包括序列表中序列3的DNA分子；(a2)核苷酸序列是序列表中序列3的DNA分子；(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。5.含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。6.b1)-b6)中任一种的应用：b1)权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求3或4所述核酸分子，或，权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组微生物，在催化合成带有糖基修饰的核苷类似物中的应用；b2)权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求3或4所述核酸分子，或，权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组微生物，在提高催化合成带有糖基修饰的核...
【专利技术属性】
技术研发人员：王洪钟，李京美，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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