二酰基甘油酰基转移酶(DGA1)多核苷酸，和通过异源DGA1的超量表达增加酵母细胞脂质生产的方法技术

DGA1催化在酵母中将酰基‑CoA和1,2‑二酰基甘油转化成三酰甘油(TAG)和CoA的最终酶步骤。公开了在产油酵母宿主中表达编码来自圆红冬孢酵母、斯达油脂酵母、裂殖壶菌、土曲霉或麦角菌的DGA1的多核苷酸序列的方法。本文还描述了解脂耶氏酵母的改造的重组宿主细胞，其包含编码DGA1蛋白的异源DGA1多核苷酸或其功能活性部分，具有产生增加的脂质产量的能力并具有提高的葡萄糖消耗效率的特征。

Two acyl glycerol acyltransferase (DGA1) polynucleotides, and methods for increasing the production of yeast cell lipids by overexpression of heterologous DGA1

The catalysis of DGA1 in yeast in CoA and 1,2 two acyl acyl glycerol into three triacylglycerol (TAG) enzyme and CoA final steps. The method discloses a polynucleotide sequence encoding expression from rhodosporidium lipomycesstarkeyi yeast, yeast, Schizochytrium, Aspergillus terreus or ergot DGA1 in oleaginous yeast in the host. This paper also describes the recombinant host cells to understand the transformation of fat y yeast, which contains DGA1 protein encoding heterologous DGA1 polynucleotide or its functional activity, has the ability to produce lipid yield increases and has features to improve the glucose consumption efficiency.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2014年2月24号提交的美国临时申请号61/943,664的权益；其内容通过引用由此并入。专利
本专利技术的领域是产油和/或耐高温酵母的基因工程。编码异源DGA1的多核苷酸在酵母(例如，选自圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、斯达油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、裂殖壶菌(Aurantiochytriumlimacinum)、土曲霉(Aspergillusterreus)或麦角菌(Clavicepspurpurea))中的超量表达导致酵母细胞的改造的菌株，例如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，其能够有效地产生高浓度的脂质。专利技术背景脂质具有多种工业应用，包括在化妆品工业和食品工业中的应用，以及用作生物柴油和各种生物化学品的前体。微生物脂质由许多产油有机体产生，所述产油有机体包括解脂耶氏酵母(BeopoulosA等人，Y.lipolyticaasamodelforbio-oilproduction.ProgLipidRes.2009年11月；48(6):375-87)。产油有机体中的脂质产量可通过正调节和/或负调节或删除脂质通道中所涉及的基因来增加(TaiM等人，EngineeringthepushandpulloflipidbiosynthesisinoleaginousyeastY.lipolyticaforbiofuelproduction.MetabEng.2013年1月；15:1-9；BeopoulosA等人，ControloflipidaccumulationintheyeastY.lipolytica.ApplEnvironMicrobiol.2008年12月；74(24):7779–7789)。例如，据报道天然解脂耶氏酵母DGA1的正调节显著增加脂质产量和生产率(TaiM等人，MetabEng.2013年1月；15:1-9)。DGA1(二酰基甘油酰基转移酶)是三酰甘油(TAG)合成的最终步骤中所涉及的脂质通道的关键组分之一，三酰甘油是脂质的主要组分(BeopoulosA等人，IdentificationandcharacterizationofDGA2,anacyltransferaseoftheDGAT1acyl-CoA:diacylglycerolacyltransferasefamilyintheoleaginousyeastY.lipolytica.Newinsightsintothestoragelipidmetabolismofoleaginousyeasts.ApplMicrobiolBiotechnol.2012年2月；93(4):1523-37)。Tai2013出版物公开了数据，其表明DGA1效率可能是对于产油有机体中的高水平脂质累积而言关键的重要因素。除了同源基因的操纵以外，异源基因也可被引入宿主基因组中并对脂质生产和组成具有显著影响(CourchesneNM等人，Enhancementoflipidproductionusingbiochemical,geneticandtranscriptionfactorengineeringapproaches.JBiotechnol.2009年4月20号141(1-2):31-41)。另外，其它产油酵母，例如圆红冬孢酵母和斯达油脂酵母，能够累积与野生型解脂耶氏酵母菌株相比显著更多的脂质(SitepuIR等人，Manipulationofcultureconditionsalterslipidcontentandfattyacidprofilesofawidevarietyofknownandnewoleaginousyeastspecies.BioresourTechnol.2013年9月；144:360-9；LiangMH等人，Advancingoleaginousmicroorganismstoproducelipidviametabolicengineeringtechnology.ProgLipidRes.2013年10月；52(4):395-408；AgeitosJM等人，Oilyyeastsasoleaginouscellfactories.ApplMicrobiolBiotechnol.2011年5月；90(4):1219-27；PapanikolaouS等人，Lipidsofoleaginousyeasts.PartI:Biochemistryofsinglecelloilproduction.EuropeanJournalofLipidScienceandTechnology2011年6月；113(8):1031-1051；PanLX等人，IsolationofOleaginousYeasts,FoodTechnol.Biotechnol.200947(2):215–220；RatledgeC等人，Thebiochemistryandmolecularbiologyoflipidaccumulationinoleaginousmicroorganisms.AdvApplMicrobiol.200251:1-51；KanekoH等人，Lipidcompositionof30speciesofyeast.Lipids.1976年12月；11(12):837-44)。尽管尝试通过来自高山被孢霉(Mortierellaalpine)的异源DGA1的超量表达来增加解脂耶氏酵母中的脂质产量，但是未报道对于脂质生产水平有显著影响(美国专利7,198,937)。值得注意地，申请人已通过超量表达编码来自高度产油有机体的DGA1的多核苷酸解决了长期存在的问题。这些多核苷酸，当被引入酵母(例如解脂耶氏酵母)中时，产生与超量表达原生解脂耶氏酵母DGA1的菌株相比能够具有增加的脂质产量的改造的酵母菌株。
技术实现思路
本专利技术涉及在酵母(例如解脂耶氏酵母)中编码来自高度产油有机体的DGA1的多核苷酸的超量表达，所述有机体例如圆红冬孢酵母、斯达油脂酵母、裂殖壶菌、土曲霉和麦角菌。所述DGA1和编码的多肽可用于操纵生产商业可用油、三酰甘油和微生物(特别是酵母)中的脂质。具体地，本专利技术涉及通过引入异源DGA1多核苷酸来增加酵母(例如解脂耶氏酵母)中的脂质的产量。数种来自最有效的脂质生产有机体的DGA1基因在解脂耶氏酵母中的超量表达导致当与解脂耶氏酵母中的原生DGA1的超量表达相比时解脂耶氏酵母脂质产量的显著增加。本专利技术的一个方面涉及用于产生重组酵母细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)将重组DNA构建物引入酵母细胞中，所述构建物包含选自以下的异源多核苷酸：i)包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16或SEQIDNO:18中所列的核苷酸序列或其补体的核酸分子；和ii)与SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16或SEQIDNO:18中所列的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生重组酵母细胞的方法，所述方法包括步骤：a)将重组DNA构建物引入酵母细胞中，所述重组DNA构建物包含选自以下的异源多核苷酸：i.包含SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18中所列的核苷酸序列或其补体的核酸分子；和ii.与SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18中所列的核苷酸序列或其补体具有至少80％序列同一性的核酸分子；和b)表达选自以下的异源多肽：i.SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中所列的氨基酸序列或其生物活性部分；和ii.与SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中所列的氨基酸序列或其生物活性部分具有至少80％序列同一性的多肽；和c)在用于增加脂质产量的条件下培养酵母细胞。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.24 US 61/9436641.一种用于产生重组酵母细胞的方法，所述方法包括步骤：a)将重组DNA构建物引入酵母细胞中，所述重组DNA构建物包含选自以下的异源多核苷酸：i.包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16或SEQIDNO:18中所列的核苷酸序列或其补体的核酸分子；和ii.与SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16或SEQIDNO:18中所列的核苷酸序列或其补体具有至少80％序列同一性的核酸分子；和b)表达选自以下的异源多肽：i.SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15或SEQIDNO:17中所列的氨基酸序列或其生物活性部分；和ii.与SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15或SEQIDNO:17中所列的氨基酸序列或其生物活性部分具有至少80％序列同一性的多肽；和c)在用于增加脂质产量的条件下培养酵母细胞。2.权利要求1所述的方法，其中所述酵母细胞是解脂耶氏酵母。3.权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸选自与SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16和SEQIDNO:18中所列的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子。4.权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸选自SEQIDNO:6,SEQIDNO:8和SEQIDNO:10中所列的核苷酸序列。5.权利要求1所述的方法，其中所述多肽选自与SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15和SEQIDNO:17中所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽。6.权利要求1所述的方法，其中所述多肽选自SEQIDNO:5,SEQIDNO:7和SEQIDNO:9中所列的核苷酸序列。7.一种包含选自以下的异源多核苷酸的分离的宿主细胞：a)包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16或SEQIDNO:18中所列的核苷酸序列或其补体的核酸分子；和b)包含与SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16或SEQIDNO:18中所列的核苷酸序列或其补体具有至少80％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。8.权利要求7所述的分离的宿主，其中所述多核苷酸选自与SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16和SEQIDNO:18中所列的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核酸分子。9.权利要求7所述的分离的宿主细胞，其中所述多核苷酸选自SEQIDNO:6,SEQIDNO:8和SEQIDNO:10中所列的核苷酸序列。10.权利要求7所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母或真菌。11.权利要求10所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母，且所述酵母是产油和\...

【专利技术属性】
技术研发人员：EE布雷夫诺瓦，AJ肖四世，EH格林哈根，
申请(专利权)人：诺沃吉公司，
类型：发明
国别省市：美国;US