增强产油酵母中核心脂质的生产制造技术

本发明专利技术公开了包含一种或更多种例如相对于相同类型的未经修饰细胞提高细胞的脂质含量的遗传修饰的转化细胞。本发明专利技术还公开通过提高细胞中一种或更多种蛋白质的活性和/或通过降低细胞中一种或更多种蛋白质的活性来提高细胞脂质含量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增强产油酵母中核心脂质的生产相关申请本申请要求于2014年12月30日提交的美国临时专利申请序列号62/097,781的优先权权益。序列表本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用整体并入本文。于2015年12月11日创建的所述ASCII副本命名为NGX03825SL.txt并且大小为575,737字节。
技术介绍
脂质是食品和化妆品工业中不可或缺的成分，并且其是生物柴油和生化工业中的重要前体。许多产油微生物产生脂质，包括已良好表征的酵母，解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。产油微生物可容易地且有成本效益地大规模培养，这表明用于生物柴油和生物化学生产的广泛适用性。微生物还可被工程化成生产食品工业和饮料工业的高价值产品。此外，这些产品通常被隔离在微生物中，这可以有利于其分离和纯化。微生物以不同的速率和不同的效率生产脂质产品。真核生物中的脂质产生通常如下进行：在线粒体中通过丙酮酸脱氢酶将丙酮酸氧化成乙酰CoA，并且随后通过代谢中间体柠檬酸将乙酰CoA输出到细胞溶质中。线粒体丙酮酸氧化和柠檬酸输出导致在线粒体中净累积还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。然而，线粒体中NADH的累积对于脂质产生来说不是最佳的，部分地是因为线粒体NADH不能还原细胞溶质酮，这导致总脂质产率较低。产油生物的脂质产率可以通过上调、下调或缺失参与脂质途径的基因来提高。然而，即便作最乐观的估计成功的酶调节不能被预测。例如，在解脂耶氏酵母中过表达来自高山被孢霉属(Mortierellaalpine)的2型二酰基甘油酰基转移酶对脂质含量没有显著作用(美国专利号7,198,937；其在此通过引用并入)。
技术实现思路
在一些方面，本专利技术涉及一种转化细胞，其包含第一遗传修饰和第二遗传修饰，其中所述第一遗传修饰提高细胞中磷酸转酮酶蛋白质的活性，并且所述第二遗传修饰提高细胞中磷酸乙酰转移酶蛋白质的活性。在一些实施方案中，本专利技术涉及一种转化细胞，其包含第一遗传修饰、第二遗传修饰、第三遗传修饰和第四遗传修饰，其中所述第一遗传修饰提高细胞中磷酸转酮酶蛋白质的活性，所述第二遗传修饰提高细胞中磷酸乙酰转移酶蛋白质的活性，所述第三遗传修饰提高细胞中果糖-1,6-二磷酸酶蛋白质的活性，并且所述第四遗传修饰降低细胞中磷酸果糖激酶蛋白质的活性。在一些实施方案中，本专利技术涉及一种转化细胞，其包含第一遗传修饰、第二遗传修饰和第三遗传修饰，其中所述第一遗传修饰提高细胞中丙酮酸脱羧酶蛋白质的活性，所述第二遗传修饰提高细胞中磷酸乙酰转移酶蛋白质的活性，并且所述第三遗传修饰提高细胞中乙酸激酶的活性。在一些实施方案中，本专利技术涉及一种转化细胞，其包含第一遗传修饰、第二遗传修饰和第三遗传修饰，其中所述第一遗传修饰提高细胞中柠檬酸/草酰乙酸线粒体转运蛋白的活性，所述第二遗传修饰提高细胞中细胞溶质苹果酸酶蛋白质的活性，并且所述第三遗传修饰提高细胞中细胞溶质内丙酮酸羧化酶蛋白质的活性。在一些实施方案中，本专利技术涉及一种转化细胞，其包含第一遗传修饰和第二遗传修饰，其中所述第一遗传修饰提高细胞中柠檬酸/草酰乙酸线粒体转运蛋白的活性，并且所述第二遗传修饰提高细胞的NADH特异性烯酰基酰基载体还原酶活性。在一些方面，本专利技术涉及由本专利技术的转化细胞获得的产品。在一些实施方案中，所述产品包含油、脂质、脂肪酸、脂肪醇、三酰基甘油酯、类异戊二烯或法呢烯。所述产品可包含硬脂酸、油酸、亚油酸、癸酸、辛酸、己酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸或角鲨烯。例如，所述产品可以是油酸。在一些方面，本专利技术涉及提高细胞的脂质含量的方法，其包括用编码磷酸转酮酶蛋白质的第一核苷酸序列转化所述细胞，以及用编码磷酸乙酰转移酶蛋白质的第二核苷酸序列转化所述细胞。在一些实施方案中，本专利技术涉及提高细胞的脂质含量的方法，其包括用编码磷酸转酮酶蛋白质的第一核苷酸序列转化所述细胞，用编码磷酸乙酰转移酶蛋白质的第二核苷酸序列转化所述细胞，用编码果糖-1,6-二磷酸酶蛋白质的第三核苷酸序列编码所述细胞，以及用降低细胞中天然磷酸果糖激酶蛋白质的活性的第四核苷酸序列转化所述细胞。在一些实施方案中，本专利技术涉及提高细胞的脂质含量的方法，其包括用编码丙酮酸脱羧酶蛋白质的第一核苷酸序列转化所述细胞，用编码磷酸乙酰转移酶蛋白质的第二核苷酸序列转化所述细胞，以及用编码乙酸激酶蛋白质的第三核苷酸序列转化所述细胞。在一些实施方案中，本专利技术涉及提高细胞的脂质含量的方法，其包括用编码柠檬酸/草酰乙线粒体转运蛋白的第一核苷酸序列转化所述细胞，用编码细胞溶质苹果酸酶蛋白质的第二核苷酸序列转化所述细胞，以及用编码细胞溶质丙酮酸羧化酶蛋白质的第三核苷酸序列转化所述细胞。在一些实施方案中，本专利技术涉及提高细胞的脂质含量的方法，其包括用编码柠檬酸/草酰乙酸线粒体转运蛋白的第一核苷酸序列转化所述细胞，以及用第二核苷酸序列转化所述细胞。第二核苷酸序列可以编码NADH特异性烯酰基酰基载体还原酶蛋白质，或者第二核苷酸序列可以能够与天然I型脂肪酸合酶烯酰还原酶基因中的核苷酸序列重组，并且用第二核苷酸序列转化细胞可提高细胞的NADH特异性烯酰基酰基载体还原酶活性。转化细胞可选自由藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母组成的组。细胞可以是酵母。例如，细胞可以是选自由Arxula酵母(Arxulaadeninivorans)、酿酒酵母属(Saccharomycescerevisiae)和解脂耶氏酵母属组成的组的酵母。参照下面的描述、附图和权利要求，将更好地理解本专利技术的这些及其他特征、方面和优点。附图简述图1示出了在未经修饰酵母中产生乙酰CoA和NADPH的途径。图2示出了一条新的磷酸转酮酶途径。图3示出了一条新的磷酸转酮酶途径。图4示出了一条新的丙酮酸脱羧酶途径。图5示出了一条新的柠檬酸输出物途径。图6示出了一条新的柠檬酸输出物途径。图7是用于在酵母中过表达来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的磷酸乙酰转移酶基因(SEQIDNO：116)的pNC582构建体的图谱。“2μori”表示来自2μ环质粒的酵母复制起点；“pMB1ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌(E.coli)pMB1复制起点；“AmpR”表示用作氨苄西林的选择标记的bla基因；“PR11”表示酿酒酵母(S.cerevisiae)FBA1启动子-822至-1；“NG4”表示用作用潮霉素的选择标记的大肠杆菌(Escherichiacoli)hph基因；“TER6”表示停止后205bp的酿酒酵母FBA1终止子；“PR4”表示解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)EXP1启动子-999至-1；“NG321”表示由LifeTechnologies合成的天然枯草芽孢杆菌枯草亚种168PTAcDNA(SEQIDNO：116)；“TER1”表示停止后300bp的解脂耶氏酵母CYC1终止子；“ScURA3”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷标记。图8是显示通过将细胞提取物与乙酰CoA和DTNB一起孵育进行的测定在412nm的吸光度的图。标记为NG321、NG322、NG324、NG309、NG310和NG311的细胞提取物是来自以下酿酒酵母的细胞提取物：其各自包含可将乙酰CoA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转化细胞，其包含第一遗传修饰、第二遗传修饰和第三遗传修饰，其中：所述第一遗传修饰提高所述细胞中磷酸转酮酶蛋白质的活性；所述第二遗传修饰提高所述细胞中磷酸乙酰转移酶蛋白质的活性；并且所述第三遗传修饰提高所述细胞中果糖1,6二磷酸酶蛋白质的活性或者降低所述细胞中天然磷酸果糖激酶蛋白质、天然果糖二磷酸醛缩酶蛋白质或天然丙糖磷酸异构酶蛋白质的活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.30 US 62/097,7811.一种转化细胞，其包含第一遗传修饰、第二遗传修饰和第三遗传修饰，其中：所述第一遗传修饰提高所述细胞中磷酸转酮酶蛋白质的活性；所述第二遗传修饰提高所述细胞中磷酸乙酰转移酶蛋白质的活性；并且所述第三遗传修饰提高所述细胞中果糖1,6二磷酸酶蛋白质的活性或者降低所述细胞中天然磷酸果糖激酶蛋白质、天然果糖二磷酸醛缩酶蛋白质或天然丙糖磷酸异构酶蛋白质的活性。2.根据权利要求1所述的转化细胞，其中所述第一遗传修饰是使用第一核酸的转化，并且所述第一核酸编码磷酸转酮酶蛋白质。3.根据权利要求2所述的转化细胞，其中所述第一核酸编码与SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123或SEQIDNO:125所示的序列或者其中任一个的生物活性部分具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的转化细胞，其中所述第二遗传修饰是使用第二核酸的转化，并且所述第二核酸编码磷酸乙酰转移酶蛋白质。5.根据权利要求4所述的转化细胞，其中所述第二核酸编码与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的序列或者其中任一个的生物活性部分具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的转化细胞，其中所述第三遗传修饰提高所述细胞中果糖1,6二磷酸酶蛋白质的活性，所述第三修饰是使用第三核酸的转化，并且所述第三核酸编码果糖1,6二磷酸酶蛋白质。7.根据权利要求1至5中任一项所述的转化细胞，其中所述第三遗传修饰降低所述细胞中天然磷酸果糖激酶蛋白质、天然果糖二磷酸醛缩酶蛋白质或天然丙糖磷酸异构酶蛋白质的活性，并且所述第三遗传修饰是敲除突变。8.根据权利要求1至7中任一项所述的转化细胞，其还包含选自由以下所组成的组的第四遗传修饰：降低所述细胞中天然转醛醇酶蛋白质、天然甘油醛3-磷酸脱氢酶蛋白质、天然磷酸甘油酸激酶蛋白质、天然磷酸甘油酸变位酶蛋白质、天然烯醇化酶蛋白质或天然丙酮酸激酶蛋白质的活性的遗传修饰；以及提高所述细胞中可溶性转氢酶蛋白质或外部氧化还原酶蛋白质的活性的遗传修饰。9.根据权利要求8所述的转化细胞，其中：所述第四遗传修饰降低所述细胞中天然转醛醇酶蛋白质、天然甘油醛3-磷酸脱氢酶蛋白质、天然磷酸甘油酸激酶蛋白质、天然磷酸甘油酸变位酶蛋白质、天然烯醇化酶蛋白质或天然丙酮酸激酶蛋白质的活性；并且所述第四遗传修饰是敲除突变。10.根据权利要求8所述的转化细胞，其中：所述第四遗传修饰提高所述细胞中可溶性转氢酶蛋白质或外部氧化还原酶蛋白质的活性；并且所述第四遗传修饰是使用编码所述可溶性转氢酶蛋白质或外部氧化还原酶蛋白质的核酸的转化。11.根据权利要求1至10中任一项所述的转化细胞，其中所述细胞选自由藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母组成的组。12.根据权利要求11所述的转化细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：Arxula酵母属(Arxula)、曲霉属(Aspegillus)、裂殖壶菌属(Aurantiochytrium)、假丝酵母属(Candida)、麦角菌属(Claviceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、地霉属(Geotrichum)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、柯达酵母属(Kodamaea)、白冬孢酵母属(Leucosporidiella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、Ogataea酵母属(Ogataea)、毕赤酵母属(Pichia)、原壁菌属(Prototheca)、根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、银耳属(Tremella)、毛孢子菌属(Trichosporon)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)。13.根据权利要求12所述的转化细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：Arxula酵母(Arxulaadeninivorans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusorzyae)、土曲霉(Aspergillusterreus)、裂殖壶菌(Aurantiochytriumlimacinum)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、麦角菌(Cl...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·J·肖四世，J·P·范迪肯，A·卡明埃尼，J·弗里德兰德，V·塔萨科拉科莱兹，M·汉密尔顿，E·E·不雷夫诺瓦，
申请(专利权)人：诺沃吉公司，
类型：发明
国别省市：美国,US