一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒及其制备和使用方法技术

本发明专利技术涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒及其制备和使用方法，包括以下组分：TPA包被板条、TPA标准品及质控品、TPA酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B。本发明专利技术还涉及TPA检测试剂盒的制备及使用方法。本发明专利技术中检测试剂盒具有高灵敏度、高敏感性、特异性和较宽的线性范围，将其用来检测TPA可大大提高检测率。

【技术实现步骤摘要】
一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒及其制备和使用方法
本专利技术涉及免疫检测分析
，具体涉及一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒及其制备和使用方法。
技术介绍
组织多肽抗原(TPA)的分子量17,000-43,000，由B1、B2和C三个亚基组成，其活性主要在B1。TPA主要存在于胎盘和大部分肿瘤组织中，各种恶性肿瘤(卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、睾丸肿瘤等)患者血清TPA的检出率(以>130U/L血清为阳性)可从20％至90％，有人认为高达80％-100％，它的存在与肿瘤发生部位、组织类型均无相关性,,然而在观察疗效上则有较高的敏感性。TPA最早于1957年在恶性肿瘤组织中被发现。目前认为TPA属于细胞骨架蛋白类，与细胞内的中间丝状体，细胞分裂素具同源性。在体外实验中，抗TPA抗体可与细胞分裂素8，18和19起抗原抗体反应。体外培养时有丝分裂期间的增殖细胞TPA分泌活跃，因此血液内TPA水平与细胞分裂增殖程度密切相关，恶性肿瘤细胞分裂，增殖活跃，所以血清中TPA水平增高，临床上常用于迅速增殖的恶性肿瘤的辅助诊断，特别是已知肿瘤的疗效监测。组织多肽抗原升高见于肺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、急性肝炎、胰腺炎、肺炎、消化道肿瘤，另外，正常人阳性率4.7％，但有相当一部分非恶性肿瘤患者血清中有TPA存在，其阳性率约为14％-35％，以下呼吸道、肝胆及尿路感染者多见，故TPA亦非肿瘤所特有的标志。在恶性肿瘤者中，TPA的增高往往是持续性的，因此，若进行连续监测，常常有利于恶性肿瘤与非恶性病变的鉴别。TPA作为一项肿瘤标志尚有以下临床意义：肿瘤患者术前TPA增高非常显著者，常提示预后不良；经治疗病情好转后，TPA量再次增高，提示有肿瘤复发；与CEA同时检测可明显提高乳腺癌诊断的正确性，有腹于恶性与非恶性乳腺病变之间的鉴别诊断。恶性肿瘤患者血清TPA水平可显著升高。经治疗好转后，TPA水平降低；若TPA再次增高，提示有肿瘤复发。TPA与CEA同时检测可有利于恶性与非恶性乳腺病的鉴别诊断。80％的卵巢癌患者血中TPA升高。此外，肺癌、急性肝炎、胰腺炎、肺炎等TPA水平也可增高。目前组织多肽抗原的检测方法主要有酶联免疫法、放射免疫分析法等，然而这些方法具有线性范围窄，检测时间长等缺点，无法满足临床需求，因此寻找一种更有效的检测方式就成了临床应用的关键。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种可定量检测、高灵敏度、高敏感性、高特异性的组织多肽抗原TPA检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒及其制备和使用方法，所述试剂盒包括以下组分：TPA包被板条、TPA标准品及质控品、TPA酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B，所述TPA包被板条为包被有TPA抗体的化学发光板，所述TPA抗体为鼠源的单克隆抗体，所述TPA抗体的包被浓度为1-5μg/mL；所述TPA酶结合物为辣根过氧化酶标记的TPA单克隆抗体，所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2000-1:3000的比例稀释；所述TPA标准品及质控品均由TPA标准品和标准品稀释液配制而成，所述TPA标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；所述TPA质控品的浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL，所述TPA抗体的包被浓度为3μg/mL；所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2500的比例稀释；所述浓缩洗涤液为pH7.4磷酸盐缓冲液，且每1L磷酸盐缓冲液中还含有0.1％-0.2％v/v吐温-20和0.4％-0.6％v/vProclin-300；所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06和对位碘酚0.006-0.008g；所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.15-0.3ml。一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)配制浓缩洗涤液称取NaCl240g、Na2HPO4.12H2O107.4g、NaH2PO4.2H2O8.1g、KCl6.0g用纯水溶解，再量取1.5mL吐温-20、5mLProclin-300分别放入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得浓缩洗涤液；(2)制备TPA包被板条用pH7.4的磷酸盐缓冲液将TPA单克隆抗体稀释至浓度为1-5μg/mL作为包被缓冲溶液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3-3.5h后在2～8℃条件下静置22-24h，将TPA单克隆抗体吸附于微孔板上，再用步骤(1)中浓缩洗涤液稀释后进行洗涤、用封闭液进行封闭和保护，经过干燥制得TPA包被板条；(3)配制TPA标准品和质控品用标准品稀释液将TPA标准品按比例稀释成0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列浓度，建立定量标准品；用标准品稀释液将TPA标准品稀释成2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的系列浓度，建立定量质控品；(4)配制TPA酶结合物将辣根过氧化酶标记的TPA单克隆抗体溶液与酶结合物稀释液稀释按照1:2000-1:3000的比例配制；(5)配制发光底物液A和发光底物液B发光底物液A：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06g、对位碘酚0.006-0.008g进行配制；发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、过氧化氢0.15-0.3ml进行配制；(6)将所述步骤(1)、(3)、(4)和(5)中配制的酶结合物、标准品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B进行分装。作为一种优选的技术方案，所述步骤(3)中标准品稀释液为pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液，且每1LTris-HCl缓冲溶液中还含有8-12g牛血清白蛋白。作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)中酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g酪蛋白、9-11％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0g的酶稳定剂。本专利技术的第三个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种检测组织多肽抗原的检测方法。一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)样品收集取待测者血液，静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟；(2)加样检测S1.将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；S2.将浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；S3.根据TPA标准品、质控品及待测标本确定所需孔数；S4.取TPA标准品、质控品及样本各50μL加入相应孔内；S5.取50μLTPA酶结合物加入各孔，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：TPA包被板条、TPA标准品及TPA质控品、TPA酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B；所述TPA包被板条为包被有抗TPA单克隆抗体的化学发光板，所述抗TPA单克隆抗体为鼠源的单克隆抗体，所述抗TPA单克隆抗体的包被浓度为1‑5μg/mL；所述TPA酶结合物为辣根过氧化酶标记的与包被配对的另一株TPA单克隆抗体，所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2000‑1:3000的比例稀释；所述TPA标准品及TPA质控品分别由TPA标准品和标准品稀释液配制而成，所述TPA标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；所述TPA质控品的浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL；所述TPA抗体的包被浓度为3μg/mL；所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2500的比例稀释；所述浓缩洗涤液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，每1L磷酸盐缓冲液中含有0.1％‑0.2％v/v吐温‑20和0.4％‑0.6％v/v Proclin‑300；所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O‑双三甲硅基乙酰胺2.3‑2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3‑1.6g、3‑氨基邻苯二甲酰肼0.03‑0.06和对位碘酚0.006‑0.008g；所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O‑双三甲硅基乙酰胺2.3‑2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3‑1.6g和过氧化氢0.15‑0.3ml。...

【技术特征摘要】
1.一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：TPA包被板条、TPA标准品及TPA质控品、TPA酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B；所述TPA包被板条为包被有抗TPA单克隆抗体的化学发光板，所述抗TPA单克隆抗体为鼠源的单克隆抗体，所述抗TPA单克隆抗体的包被浓度为1-5μg/mL；所述TPA酶结合物为辣根过氧化酶标记的与包被配对的另一株TPA单克隆抗体，所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2000-1:3000的比例稀释；所述TPA标准品及TPA质控品分别由TPA标准品和标准品稀释液配制而成，所述TPA标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；所述TPA质控品的浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL；所述TPA抗体的包被浓度为3μg/mL；所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2500的比例稀释；所述浓缩洗涤液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，每1L磷酸盐缓冲液中含有0.1％-0.2％v/v吐温-20和0.4％-0.6％v/vProclin-300；所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06和对位碘酚0.006-0.008g；所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.15-0.3ml。2.一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)配制浓缩洗涤液称取NaCl240g、Na2HPO4.12H2O107.4g、NaH2PO4.2H2O8.1g用纯水溶解，再量取1.5mL吐温-20、5mLProclin-300分别放入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得浓缩洗涤液；(2)制备TPA包被板条用pH7.4的磷酸盐缓冲液将抗TPA单克隆抗体稀释至浓度为1-5μg/mL作为包被缓冲溶液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3-3.5h后在2～8℃条件下静置24h，将抗TPA单克隆抗体吸附于微孔板上，再用步骤(1)中浓缩洗涤液稀释后进行洗涤、用封闭液进行封闭和保护，经过干燥制得TPA包被板条；(3)配制TPA标准品品和TPA质控品用标准品品稀释液将TPA标准品按比例稀释成0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列浓度，建立定量标准品；用标准品稀释液将T...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨致亭，李庭希，李峰，梁波，杨锋斌，
申请(专利权)人：潍坊市康华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37