提供了一种禽流感病毒H5亚型Re‑6株抗体鉴定试剂盒，包括以下成分：1）包被有禽流感H5亚型Re‑6株特异性抗原的酶标板、2）辣根过氧化物酶标羊抗鸡IgG抗体溶液、3）H5亚型Re‑6株抗体阳性对照、4）H5亚型Re‑6株抗体阴性对照、5）显色底物、6）终止液、7）洗涤液和8）样本稀释液。利用该试剂盒，可特异性地准确检测动物血清中的禽流感病毒H5亚型Re‑6株抗体。针对当前禽流感防控的复杂形势，具有非常广阔的市场前景，可在基层兽医实验室检测和政府监管中发挥重大作用。
【技术实现步骤摘要】
禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒
本专利技术属于动物疫病检测领域，涉及一种禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒。
技术介绍
禽流感（avianinfluenza）是由甲型流感病毒引起的动物传染病。根据其致病能力差异可分为高致病性型和普通型，H5亚型即属于高致病性病毒。我国目前防控禽流感病毒H5的主要疫苗毒株为H5Re-6株、Re-7株、Re-8株等，批准的疫苗产品为单联苗或多联苗，来源于单个亚型毒株（如青岛易邦生物工程有限公司生产的重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株））或者多个亚型毒株（如哈药集团生物疫苗有限公司生产的禽流感二价灭活疫苗（H5N1Re-6株+H9N2Re-2株））。为了监控疫苗免疫效果，准确评价免疫动物抗体效价，常采用免疫学方法如血凝和酶联免疫法（ELISA）。实际生产中动物个体差异会导致其对多联疫苗的反应不同，血清中抗体总效价高不代表其对不同流感病毒多种亚型的抵抗能力强，还要进一步监测分析其针对不同亚型流感病毒的抗体效价，才能做到防控准确，降低禽流感爆发带来的风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒，其能够特异性地准确检测禽类血清中的禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体，为H5亚型禽流感防控策略提供参考。本专利技术所提供的禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒，主要包括：1）包被有禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原的酶标板；2）辣根过氧化物酶标羊抗鸡IgG抗体溶液；3）H5亚型Re-6株抗体阳性对照；4）H5亚型Re-6株抗体阴性对照；5）显色底物；6）终止液；7）洗涤液；8）样本稀释液。其中所述的包被有禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原的酶标板中禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原为重组表达的禽流感H5亚型Re-6株HA抗原，其是通过昆虫细胞杆状病毒表达系统重组表达获得。进一步地，所述的禽流感H5亚型Re-6株HA抗原基因来源于GenBank公开序列经过人工突变筛选，其序列信息如SEQIDNo.1所列，扩增所述HA基因所用引物为：上游引物：5’-CGACCCGGGGATTGTAGTGTAGCAGGATG-3’，下游引物：5’-CGCCAGCTGTTCCACTTCACTTTTCATAATTG-3’。所述辣根过氧化物酶标羊抗鸡IgG抗体溶液为商品化抗体稀释后分装。所述H5亚型Re-6株抗体阴性对照为SPF血清。所述H5亚型Re-6株抗体阳性对照为标准H5亚型Re-6株阳性血清。所述显色底物单组份TMB显色底物。所述终止液为0.5M硫酸溶液。所述洗液为添加有0.1%吐温-20的0.01MPBS（pH7.2）溶液。本专利技术的另一个目的是提供上述禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤：1)禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原的制备根据如SEQIDNo1所列的HA基因序列，设计特异性引物，通过PCR技术扩增，并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac1中，构建含有H5Re6HA基因的重组质粒，转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10BacE.coli感受态中，经半乳糖苷酶的蓝白斑筛选，获得重组杆粒，然后转染SF9细胞以获得重组杆状病毒，HA基因会随着杆状病毒的增殖而表达。表达产物经镍柱纯化后，SDS-PAGE电泳鉴定，可见与预期大小相符的目的条带。2)禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原包被板的制备包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释至1µg/ml，加入至酶标板条中，4℃过夜，PBST清洗一次，拍干后用5%BSA封闭，37℃2小时，拍干备用。3)试剂盒其他组分的配液、分装及组装：将制备的包被有禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原的酶标板用铝箔袋真空密封；商品化辣根过氧化物酶标羊抗鸡IgG抗体稀释后添加稳定剂定量分装；取SPF鸡血清定量分装作为H5亚型Re-6株抗体阴性对照；取标准H5亚型Re-6株阳性血清定量分装作为H5亚型Re-6株抗体阳性对照；取商品化的单组份TMB底物液分装；取终止液、样本稀释液、洗涤液等分装；打印标签，并粘贴至各个组分瓶体或包装袋上，继续与试剂盒操作说明书、质控报告等放置于试剂盒外包装盒中。至此，禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒制备完毕。本专利技术还涉及一种使用禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒检测血清中禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体的检测方法，包括如下步骤：第一步，将待测血清样本按照一定比例稀释备用；第二步，将准备好的样品按照检测试剂盒的操作方法进行操作；第三步，利用分析软件分析数据，判断结果。本专利技术提供的禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层兽医实验室检测应用。与传统方法相比，本专利技术具有以下有益效果：1）所需原料制备简单、易于获取。2）检测无需特殊设备、耗时短、效率高。基层实验室无需自行包被酶标板，稀释好检测样本后可直接检测；检测孵育温度为室温，无需购买恒温孵育箱；整体检测时间即酶联吸附检测的反应时间不超过1h；利用酶标板96孔检测，做双孔平行，可以单次实验中同时检测至少40份样本，效率高。3）检测灵敏度高，结果可靠。本专利技术提供的禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒在当前禽流感防控形势复杂的前提下，具有非常广阔的市场前景，可在基层兽医实验室检测和政府疫情监控中发挥重大作用。附图说明图1为禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原纯化鉴定图，其中M为分子量Marker，1、2、3、4代表不同纯化时间收集的HA抗原。具体实施方式下面结合具体实施方式来进一步描述本专利技术。本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但这些实施例仅是范例性质，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围。下列方法如无特殊说明均为常规方法，试剂、仪器、设备等如无说明，均可从商业来源获得。实施例1禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原的制备(1)设计引物：针对如SEQIDNo.1所列的HA基因序列设计并合成了一对引物，上游引物为5’-CGACCCGGGGATTGTAGTGTAGCAGGATG-3’，下游引物为5’-CGCCAGCTGTTCCACTTCACTTTTCATAATTG-3’；(2)PCR扩增：反应体系：Tsingke金牌mix45µL、上下游引物（10µM）各2µL、模板质粒1µL，反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸20s，循环30次，最后72℃延伸1min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带。(3)双酶切：目的片段酶切体系：目的片段47.5µL、限制性内切酶SmaⅠ1µL、PvuⅡHF1µL、CutsmartBuffer5.5µL，载体pFastBac1酶切体系：载体15µL(1.5µg)、限制性内切酶SmaⅠ1µL、PvuⅡHF1µL、CutsmartBuffer5.5µL、ddH2O31.5µL。反应条件：先加SmaⅠ25℃反应1h,再加PvuⅡHF37℃反应0.5h。目的片段酶切产物用产物回收试剂盒回收，载体酶切产本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种禽流感病毒H5亚型Re‑6株抗体鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒主要包括以下成分：1）包被有禽流感H5亚型Re‑6株特异性抗原的酶标板；2）辣根过氧化物酶标羊抗鸡IgG抗体溶液；3）H5亚型Re‑6株抗体阳性对照；4）H5亚型Re‑6株抗体阴性对照；5）显色底物；6）终止液；7）洗涤液；8）样本稀释液；其中所述的包被有禽流感H5亚型Re‑6株特异性抗原的酶标板中禽流感H5亚型Re‑6株特异性抗原为重组表达的禽流感H5亚型Re‑6株HA抗原，其是通过昆虫细胞杆状病毒表达系统重组表达获得；进一步地，所述的禽流感H5亚型Re‑6株HA抗原基因来源于如SEQ ID No.1所列序列，扩增所述HA基因所用引物为：上游引物：5’‑CGACCCGGGGATTGTAGTGTAGCAGGATG‑3’，下游引物：5’‑CGCCAGCTGTTCCACTTCACTTTTCATAATTG‑3’；所述辣根过氧化物酶标羊抗鸡IgG抗体溶液为商品化抗体稀释后分装；所述H5亚型Re‑6株抗体阴性对照为SPF血清；所述H5亚型Re‑6株抗体阳性对照为标准H5亚型Re‑6株阳性血清；所述显色底物单组份TMB显色底物；所述终止液为0.5M硫酸溶液；所述洗液为添加有0.1%吐温‑20的0.01 M PBS（pH7.2）溶液。...
【技术特征摘要】
1.一种禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒主要包括以下成分：1）包被有禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原的酶标板；2）辣根过氧化物酶标羊抗鸡IgG抗体溶液；3）H5亚型Re-6株抗体阳性对照；4）H5亚型Re-6株抗体阴性对照；5）显色底物；6）终止液；7）洗涤液；8）样本稀释液；其中所述的包被有禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原的酶标板中禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原为重组表达的禽流感H5亚型Re-6株HA抗原，其是通过昆虫细胞杆状病毒表达系统重组表达获得；进一步地，所述的禽流感H5亚型Re-6株HA抗原基因来源于如SEQIDNo.1所列序列，扩增所述HA基因所用引物为：上游引物：5’-CGACCCGGGGATTGTAGTGTAGCAGGATG-3’，下游引物：5’-CGCCAGCTGTTCCACTTCACTTTTCATAATTG-3’；所述辣根过氧化物酶标羊抗鸡IgG抗体溶液为商品化抗体稀释后分装；所述H5亚型Re-6株抗体阴性对照为SPF血清；所述H5亚型Re-6株抗体阳性对照为标准H5亚型Re-6株阳性血清；所述显色底物单组份TMB显色底物；所述终止液为0.5M硫酸溶液；所述洗液为添加有0.1%吐温-20的0.01MPBS（pH7.2）溶液。2.根据权利要求1所述的抗体鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备方法主要包括以下步骤：禽流感H5亚型Re-6株特异性抗原的制备根据如SEQIDNO.1所列的序列设计特异性引物，通过PC...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗伏兵，于在江，刘晓冬，李月，冯小宇，杨春江，沈光年，王慧强，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，北京市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京,11
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