一种大肠杆菌表达载体pBMcopA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌表达载体pBMcopA及其应用，所述表达载体由pBM16A‑T构建而来，其中pBM16A‑T的TA连接位点区域添加copA启动子以及酶切位点BamH I和Nde I。还公开了表达载体pBMcopA‑pigC，其由pBMcopA构建，还包括了目的基因，目的基因为灵菌红素缩合酶(pigC)基因。本发明专利技术还提供上述两种表达载体的构建方法。所构建出的表达载体可在含铜离子ATP转运蛋白的大肠杆菌中表达目的基因，可以作为基因改造的可选质粒。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌表达载体pBMcopA及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种大肠杆菌表达载体pBMcopA及其应用。
技术介绍
随着人类对原核生物的认知，越来越多的微生物种类被发现。为了改造这些微生物，穿梭表达载体的构建已得到相当多的关注。大肠杆菌是一种易于培养，生物量容易积累的比较常见的原核细菌，且容易对其进行基因改造和重组，因此常用的穿梭质粒都是基于特定菌株和大肠杆菌之间构建。现有的大肠杆菌表达质粒大多基于T7聚合酶进行外源基因高效表达，但是在其他宿主细菌上往往并不存在T7聚合酶，而往往只能挑选该细菌自带的质粒进行改造。因此，可以通用于原核细菌进行表达的穿梭质粒的研究和生产需要大量增加。选择合适的原核细菌启动子及其他表达组件对现有的表达载体进行改造就有了必要。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种大肠杆菌表达载体pBMcopA，及利用该载体构建表达载体pBMcopA-pigC的应用，其能够应用在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中表达。为解决上述技术问题，本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种大肠杆菌表达载体pBMcopA，所述的表达载体pBMcopA由pBM16A-T构建而来，所述的pBM16A-T的连接位点区域添加粘质沙雷氏菌铜离子转运蛋白启动子以及酶切位点BamHI和NdeI。所述的表达载体pBMcopA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的另一方面，本专利技术提供了该表达载体pBMcopA的构建方法，包括以下步骤：1)获得含BamHI和NdeI酶切位点的铜离子ATP转运蛋白启动子片段；2)将步骤(1)得到的基因片段与载体pBM16A-T连接，获得pBMcopA质粒。具体的，所述的步骤(1)为根据粘质沙雷氏菌铜离子ATP转运蛋白启动子序列和pBM16A-T的已有酶切位点设计粘质沙雷氏菌启动子的两段式扩增引物，引物两端包含BamHI和NdeI酶切位点序列，扩增后获得基因片段。所述的获得基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述的两段式扩增引物如SEQIDNO.4～8所示。在本专利技术的另一方面所述的表达载体pBMcopA用于构建表达载体pBMcopA-pigC的应用也在本专利技术的保护范围之内。所述的表达载体pBMcopA-pigC由pBMcopA和目的基因构建得到，所述目的基因为灵菌红素缩合酶(pigC)基因。上述表达载体pBMcopA-pigC也在本专利技术的保护范围之内。所述的表达载体pBMcopA-pigC的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的表达载体pBMcopA-pigC的构建方法，包括以下步骤：1)根据粘质沙雷氏菌启动子序列和粘质沙雷氏菌灵菌红素缩合酶(pigC)序列设计三条引物，其中启动子序列下游引物同pigC上游引物具有20bp的互补序列，并扩增粘质沙雷氏菌中启动子和沙雷氏菌灵菌红素缩合酶(pigC)序列；2)使用TOUCH-DOWNPCR方法将粘质沙雷氏菌中启动子片段和沙雷氏菌灵菌红素缩合酶(pigC)片段进行重组连接，使用TOUCH-DOWNPCR方法对重组连接片段进行扩增；TOUCH-DOWNPCR的退火温度从65-55℃的11次循环中每次循环退火温度降低1℃；3)将重组连接片段和pBM16A-T载体使用DNA连接酶进行连接，得到pBMcopA-pigC。进一步的，步骤(1)中所述的三条引物核苷酸序列如SEQIDNO.9～11所示。同时所述的表达载体pBMcopA-pigC用以表达粘质沙雷氏菌灵菌红素缩合酶蛋白的应用也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的有益效果为：pBMcopA-pigC质粒含有粘质沙雷氏菌启动子及酶切位点BamHI、NdeI和pBM16A-T载体原有的多克隆位点。本专利技术通过TOUCH-DOWNPCR的方法，将粘质沙雷氏的启动子同载体连接构建出pBMcopA载体和包含沙雷氏菌灵菌红素缩合酶基因的pBMcopA-pigC载体。pBMcopA能够应用于不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中，该质粒可以作为表达载体在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中发挥表达插入基因的作用，可以作为基因改造的可选质粒。说明书附图图1是pBMcopA-pigC诱导表达SDS-PAGE电泳图。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1表达载体pBMcopA的构建在NCBI上查找关于粘质沙雷氏菌铜离子ATP转运蛋白的启动子序列，设计引物序列，并在NCBI上验证引物与多株同源菌株中的特异性，分别设计粘质沙雷氏菌铜离子ATP转运蛋白启动子前段引物和后段引物。将设计好的引物由基因测序公司进行引物合成，引物合成的方法是固相亚磷酰胺三酯法。设计的引物具体为：片段copF：cttgcatgcccgccgataaaacgccttg；片段copR：ggcatatgcaacggctcagtttttggg。根据设计好的引物，利用PCR技术扩增粘质沙雷氏菌中启动子片段，即CopA非编码区前段和后端。PCR条件设置：95℃变性5分钟；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸3分钟。20μL体系：2μL10*Taqbuffer，2μLMgCl2，1μL10mmdNTP，12μLddH2O，1μL粘质沙雷氏菌总DAN，1μL上引物，1μL下引物，0.2μLTaqDNA酶。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割回片段，最后将切割片段用胶回收试剂盒(OmegaBio-Tek,USA)回收。将胶回收的片段送往基因测序公司测序，以验证扩增片段的完整性。将测序后的启动子片段回收产物，使用克隆载体pBM16A-T连接。回收产物连接起来，得到了重组载体pBMcopA。具体连接过程为：连接体系：1μLpBM16A-TVector，3μL两段DNA连接产物，1μLdH2O,5μLSolutionI。16℃反应30分钟，将连接好的质粒加入100μL的大肠杆菌DH5α感受态中，冰中放置30分钟，42℃加热45秒，再在冰中放置1分钟，加入400μLLB培养基，37℃振荡培养40分钟，将培养液倒入含有氨苄的固体LB培养基培养过夜；挑选单菌落放入100mL含有氨苄的液体LB培养基扩大培养，最后用质粒提取试剂盒(OmegaBio-Tek,USA)提取重组载体pBMcopA。实施例2表达载体pBMcopA-pigC的构建1)根据粘质沙雷氏菌铜离子ATP转运蛋白启动子序列和沙雷氏菌灵菌红素缩合酶(pigC)序列设计三条引物，引物序列：copCR：atgtggactccttgcttaggggc；pigCF：cctaagcaaggagtccacatatgaatcctaccctggtggt；pigCR：cccaagctttgctgattagccatcggcac。其中引物copCR与引物pigCF含有20bp互补序列。2)使用PCR技术以引物copF和引物copCR，以实施例1胶回收产物为模板重新扩增粘质沙雷氏菌铜离子ATP转运蛋白启动子，使片段具有序列：ATGTGGACT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌表达载体pBMcopA，其特征在于，所述的表达载体pBMcopA由pBM16A‑T构建而来，所述的pBM16A‑T的连接位点区域添加粘质沙雷氏菌铜离子转运蛋白启动子以及酶切位点BamH I和Nde I。

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌表达载体pBMcopA，其特征在于，所述的表达载体pBMcopA由pBM16A-T构建而来，所述的pBM16A-T的连接位点区域添加粘质沙雷氏菌铜离子转运蛋白启动子以及酶切位点BamHI和NdeI。2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表达载体pBMcopA，其特征在于，所述的表达载体pBMcopA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.权利要求1所述的一种大肠杆菌表达载体pBMcopA的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获得含BamHI和NdeI酶切位点的铜离子ATP转运蛋白启动子片段；2)将步骤(1)得到的基因片段与载体pBM16A-T连接，获得pBMcopA质粒。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(1)为根据粘质沙雷氏菌铜离子ATP转运蛋白启动子序列和pBM16A-T的已有酶切位点设计粘质沙雷氏菌启动子的两段式扩增引物，引物两端包含BamHI和NdeI酶切位点序列，扩增后获得基因片段。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的获得基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述的两段式扩增引物如SEQIDNO.4～8所示。6.权利要求1所述的表达载体pBMcopA在构建表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：王以明，张叶飞，马宸，张瑾，童晋，
申请(专利权)人：成都理工大学，
类型：发明
国别省市：四川,51