一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，利用结构特异性核酸内切酶Fen1，将载体与目标基因之间杂交退火形成的带flap结构的重组DNA分子的flap链切除，形成带缺口的DNA重组质粒，转化大肠杆菌后修复缺口形成完好的环状重组DNA分子，进行DNA克隆。通过上述方式，本发明专利技术的方法能够提高显著提高目标基因与载体间的重组效率，而且只需要一对载体与目标基因的PCR片段，大大方便了操作，提高了克隆效率，能应用于重组DNA的构建（基因克隆）、DNA定点突变等，也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法。
技术介绍
基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒两步必不可少的操作。具体的克隆方法是通过限制性内切酶切割载体和目的片段，然后将载体和目的片段用连接酶连接起来。由于限制性核酸内切酶消化反应消化不完全，常常造成含有目标基因的阳性重组质粒百分比低于10%，甚至克隆失败。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。其中一种方法不需要任何酶，只需要将质粒与目标基因的PCR片段混在一起进行变性退火即可（NucleicAcidsResearch,Vol.27，e26）。但该方法有一个条件就是需要设计多条引物，PCR扩增制备4对质粒片段与目的基因片段，因此无论从费用还是复杂性方面都限制了该方法的使用。而且该方法的效率非常低，需要超高效的感受态细胞才能实现。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，通过该方法可以将目标基因插入载体的任何位点，操作简便，是一种新的不依赖于DNA连接酶的通用型克隆技术。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，包括步骤为：（1）利用引物扩增载体和目标基因，使所述载体和所述目标基因的两端产生同源区域；（2）将步骤（1）得到的所述载体和所述目标基因混合并杂交配对连接，产生flap结构，得到带flap结构的重组DNA分子；（3）将步骤（2）得到的带flap结构的重组DNA分子用结构特异性核酸内切酶Fen1切除，得到含目标基因的带缺口的重组载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组DNA的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤（1）中所述引物的序列特征为：扩增目标基因和载体的正向引物5’端的第1-40位碱基序列是互补配对的，扩增目标基因和载体的反向引物5’端的第1-40位碱基序列是互补配对的；3’端下游碱基序列与所述目标基因和载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和载体的正向引物、用于扩增目标基因和载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤（1）中还包括用限制性核酸内切酶DpnI对扩增后的载体进行消化处理，去除野生型环状质粒。在本专利技术一个较佳实施例中，，步骤（1）中所述载体和所述目标基因的两端产生20-40bp同源区域。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤（2）和（3）在同一体系中进行，步骤（2）中的杂交配对连接和步骤（3）中的切除是先在温度为95度下反应30秒，再在温度为50-70度下反应3-5分钟，如此循环10-30次，进行热循环酶切反应。在本专利技术一个较佳实施例中，所述利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与TaqDNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组载体。在本专利技术一个较佳实施例中，所述利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法用于基因点突变，包括步骤为：（1）利用引物扩增野生型SSB基因的质粒载体；（2）将步骤（1）得到的扩增后的质粒载体产生flap结构，得到带flap结构的突变型质粒载体；（3）将步骤（2）得到的带flap结构的突变型质粒载体用结构特异性核酸内切酶Fen1切除，再自我杂交配对，得到含突变型目标基因的带缺口的质粒载体；（4）步骤（3）得到的含突变型目标基因的带缺口的质粒载体转化大肠杆菌后，所述含突变型目标基因的重组DNA的缺口被修复好，得到含突变型SSB目标基因的完整重组质粒载体。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增的正向引物、用于扩增的反向引物、野生型质粒模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸；步骤（1）中还包括用限制性核酸内切酶DpnI对扩增后的载体进行消化处理，去除环状质粒模板。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤（2）和（3）在同一体系中进行，步骤（2）中的杂交配对连接和步骤（3）中的切除是先在温度为95度下反应30秒，再在温度为50-70度下反应3-5分钟，如此循环10-30次，进行热循环酶切反应；所述利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法还包括对含突变型SSB目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，培养阳性克隆，并抽提含突变型SSB目标基因的完整重组质粒载体进行测序，验证点突变。本专利技术的有益效果是：一、本专利技术利用热稳定性Fen1核酸酶能够将flap结构DNA中翘起来的单链切除，从而稳定化质粒与目标基因之间形成的互补双链区。由于采用的是热循环的反应方式，通过多轮循环之后，质粒与目标基因之间形成的带缺口的重组质粒数量大大累积，显著提高了克隆效率。二、在多片段之间有20-40bp同源区的条件下，适合多片段拼接克隆。三、操作通量大，适宜于多个目标基因同时克隆。由于在整个克隆过程中只需要Fen1这一种酶，因此可以简单的扩大克隆通量，进行大规模基因克隆。四、含有目标基因的阳性克隆率高。由于采用PCR扩增质粒载体，消除了限制性核酸内切酶消化质粒不彻底所造成的假阳性克隆，从而极大地提高了阳性克隆比例；五、本专利技术可用于基因克隆，基因片段拼接、目标基因定点突变等领域。目标基因与质粒载体无需限制性核酸内切酶消化，因此可以大大降低假阳性克隆（空质粒）百分比，提高目标基因克隆成功率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：图1是本专利技术的利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法一较佳实施例的流程图；图2是图1所述利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法的鉴定结果图；图3是本专利技术的利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法用于基因点突变的一较佳实施例的流程图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：枯草芽孢杆菌单链DNA结合蛋白SSB的基因克隆请参阅图1，提供一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，包括步骤为：（1）设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列。引物的序列特征是：（a）扩增目标基因和质粒载体的正向引物5’端的第1-20位碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因和质粒载体的反向引物5’端的第1-20位碱基序列彼此互补配对；（b）3’端下游碱基序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用引物扩增载体和目标基因，使所述载体和所述目标基因的两端产生同源区域；（2）将步骤（1）得到的所述载体和所述目标基因混合并杂交配对连接，产生flap 结构，得到带flap 结构的重组DNA分子；（3）将步骤（2）得到的带flap 结构的重组DNA分子用结构特异性核酸内切酶Fen1切除，得到含目标基因的带缺口的重组载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组DNA的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。

【技术特征摘要】
1.一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用引物扩增载体和目标基因，使所述载体和所述目标基因的两端产生同源区域；（2）将步骤（1）得到的所述载体和所述目标基因混合并杂交配对连接，产生flap结构，得到带flap结构的重组DNA分子；（3）将步骤（2）得到的带flap结构的重组DNA分子用结构特异性核酸内切酶Fen1切除，得到含目标基因的带缺口的重组载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组DNA的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。2.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述引物的序列特征为：扩增目标基因和载体的正向引物5’端的第1-40位碱基序列是互补配对的，扩增目标基因和载体的反向引物5’端的第1-40位碱基序列是互补配对的；3’端下游碱基序列与所述目标基因和载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。3.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和载体的正向引物、用于扩增目标基因和载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。4.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中还包括用限制性核酸内切酶DpnI对扩增后的载体进行消化处理，去除野生型环状质粒。5.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述载体和所述目标基因的两端产生20-40bp同源区域。6.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（2）和（3）在同一体系中进行，步骤（2）中的杂交配对连接和步骤（3）中的切除是先在温度为95度下反应30秒，再在温度为50-70度下反应3-5分钟，如此循环10-30次，进行热循环酶切反应。7.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧，田文奇，
申请(专利权)人：苏州博睐恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32