一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，利用结构特异性核酸内切酶Fen1，将载体与目标基因之间杂交退火形成的带flap结构的重组DNA分子的flap链切除，形成带缺口的DNA重组质粒，转化大肠杆菌后修复缺口形成完好的环状重组DNA分子，进行DNA克隆。通过上述方式，本发明专利技术的方法能够提高显著提高目标基因与载体间的重组效率，而且只需要一对载体与目标基因的PCR片段，大大方便了操作，提高了克隆效率，能应用于重组DNA的构建（基因克隆）、DNA定点突变等，也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法。
技术介绍
基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒两步必不可少的操作。具体的克隆方法是通过限制性内切酶切割载体和目的片段，然后将载体和目的片段用连接酶连接起来。由于限制性核酸内切酶消化反应消化不完全，常常造成含有目标基因的阳性重组质粒百分比低于10%，甚至克隆失败。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。其中一种方法不需要任何酶，只需要将质粒与目标基因的PCR片段混在一起进行变性退火即可（NucleicAcidsResearch,Vol.27，e26）。但该方法有一个条件就是需要设计多条引物，PCR扩增制备4对质粒片段与目的基因片段，因此无论从费用还是复杂性方面都限制了该方法的使用。而且该方法的效率非常低，需要超高效的感受态细胞才能实现。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用引物扩增载体和目标基因，使所述载体和所述目标基因的两端产生同源区域；（2）将步骤（1）得到的所述载体和所述目标基因混合并杂交配对连接，产生flap 结构，得到带flap 结构的重组DNA分子；（3）将步骤（2）得到的带flap 结构的重组DNA分子用结构特异性核酸内切酶Fen1切除，得到含目标基因的带缺口的重组载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组DNA的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。

【技术特征摘要】
1.一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用引物扩增载体和目标基因，使所述载体和所述目标基因的两端产生同源区域；（2）将步骤（1）得到的所述载体和所述目标基因混合并杂交配对连接，产生flap结构，得到带flap结构的重组DNA分子；（3）将步骤（2）得到的带flap结构的重组DNA分子用结构特异性核酸内切酶Fen1切除，得到含目标基因的带缺口的重组载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组DNA的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。2.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述引物的序列特征为：扩增目标基因和载体的正向引物5’端的第1-40位碱基序列是互补配对的，扩增目标基因和载体的反向引物5’端的第1-40位碱基序列是互补配对的；3’端下游碱基序列与所述目标基因和载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。3.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和载体的正向引物、用于扩增目标基因和载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。4.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中还包括用限制性核酸内切酶DpnI对扩增后的载体进行消化处理，去除野生型环状质粒。5.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述载体和所述目标基因的两端产生20-40bp同源区域。6.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（2）和（3）在同一体系中进行，步骤（2）中的杂交配对连接和步骤（3）中的切除是先在温度为95度下反应30秒，再在温度为50-70度下反应3-5分钟，如此循环10-30次，进行热循环酶切反应。7.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧，田文奇，
申请(专利权)人：苏州博睐恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32