一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，包括步骤为：用硫代化学修饰的引物扩增目标基因和质粒载体；将目标基因扩增产物和质粒载体扩增产物进行碘酒热处理；碘酒处理使得DNA双链末端形成10‑25个核苷酸长度的3’‑单链DNA，将碘酒热处理后的目标基因DNA片段与质粒载体DNA片段在常温或4度杂交配对，目标基因与质粒载体的3’‑单链DNA间彼此配对后形成含目标基因的带缺口重组质粒；所述含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒。通过上述方式，本发明专利技术采用最优的硫代修饰与单链末端长度控制策略，使得含有目标基因的阳性克隆率显著提高，且操作通量大，适宜于多个目标基因同时克隆。

【技术实现步骤摘要】
一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法
本专利技术涉及基因克隆技术，特别是涉及一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，可以用于表达载体构建和基因点突变，属于基因工程

技术介绍
基因克隆技术是蛋白质工程、基因工程、基因编辑等技术的基础。传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒这两步必不可少的操作。传统基因克隆技术缺点主要有：1)如果基因内部具有选用的限制性酶切位点，则导致无法进行该基因的克隆，该问题对长片段的基因的克隆尤其明显；2)不同基因选用的相应内切酶不一样，需要不同的限制性内切酶进行处理，因此很难同时克隆多个基因；3)限制性核酸内切酶消化反应与DNA连接酶反应，特别是限制性核酸内切酶消化反应，效率的高低直接决定着目标基因克隆能否成功。由于限制性核酸内切酶消化反应与DNA连接酶反应，常常造成含有目标基因的阳性重组质粒百分比低于10％，甚至克隆失败。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了一些连接酶非依赖性克隆方法，例如基于T4DNA聚合酶的连接酶非依赖性克隆方法(NucleicAcidsResearch,Vol.18,No.20p6069-6074)，基于外切核酸酶的连接酶非依赖性克隆方法(NucleicAcidsRes21:5528-5529；Biotechniques27:1240-1244)。然而，基于T4DNA聚合酶的连接酶非依赖性克隆方法缺点主要有：1)需要在目标基因与线性质粒载体的5’端引入一段特定的碱基序列，导致克隆的目标基因的两端附加了一段人为的碱基序列；2)引入的一段特定碱基序列有时较难设计，造成目标基因克隆困难。而基于外切核酸酶的连接酶非依赖性克隆方法的缺陷主要包括：DNA修饰酶对DNA的处理程度较难控制，不能有效控制单链突出端长度，常常会导致DNA的完全降解或降解达不到15个核苷酸，使得基因克隆失败。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其不需要包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶，以及用来生成单链突出端的核酸外切酶、DNA重组酶等任何DNA修饰酶，而是通过碘酒热断裂硫代修饰的目标DNA和克隆载体；该方法能简化基因克隆操作、提高克隆效率与操作通量，可用于大规模基因克隆，可以用于重组载体构建和基因点突变；同时相关试剂常温储存长期稳定，储存非常简单方便。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，包括步骤为：(1)用引物扩增目标基因和质粒载体，其中引物序列的特征为：(a)5’端第1-25位间的磷酸二酯键为间隔性硫代修饰，相邻硫代修饰间相隔3-10碱基；(b)扩增目标基因和质粒载体的正向引物的5’端第1-25位间的碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因和质粒载体的反向引物的5’端第1-25位碱基序列彼此互补配对；(c)3’端下游18-25个碱基序列与待扩增的目标基因和质粒载体的DNA片段两端碱基序列配对；(2)将目标基因扩增产物和质粒载体扩增产物进行碘酒热处理；(3)将热处理后的目标基因DNA片段与质粒载体DNA片段杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；(4)所述含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤(1)中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和质粒载体的正向引物、用于扩增目标基因和质粒载体段的反向引物、目标基因与质粒载体的DNA模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。在本专利技术一个较佳实施例中，所述仅基于化学试剂的新型基因克隆方法在步骤(1)和步骤(2)之间还包括对质粒载体PCR产物用限制性核酸内切酶DpnI消化去除质粒模板。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤(2)中所述热处理时的温度为65-85℃，时间为1-15分钟。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤(3)中所述杂交配对是在室温下放置1～15分钟。在本专利技术一个较佳实施例中，所述仅基于化学试剂的新型基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组质粒的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与TaqDNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒。本专利技术的有益效果是：一、最优的硫代修饰与单链末端长度控制策略。本专利技术利用碘酒在碱性条件下断裂硫代修饰的磷酸二酯键，是纯化学方法生成单链突出端，硫代修饰的作用是定向指引断裂位点，从而使单链DNA突出端长度完全决定于硫代修饰位点的具体设计。其能够100％控制磷酸二酯键断裂生成的单链DNA突出端长度；使决定克隆效率的单链DNA突出端长度处于完全可控状态，从而能够轻易地使单链突出端处于最佳长度。同时采用间隔式硫代修饰既节约了成本，也提高了碘酒裂解效率。二、含有目标基因的阳性克隆率高。由于采用PCR扩增质粒载体，消除了限制性核酸内切酶消化质粒不彻底所造成的假阳性克隆，从而极大地提高了阳性克隆比例。由于我们的基因克隆技术克隆数和阳性克隆率超高，也可省略DpnI处理，对基因克隆成功率影响不大。三、操作通量大，适宜于多个目标基因同时克隆。基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克隆方法在整个操作过程中PCR产物不需要纯化，仅需要碘酒热处理生成长粘性末端，操作统一，因此可以简单的扩大克隆通量，进行大规模基因克隆。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：图1是本专利技术的仅基于化学试剂的新型基因克隆方法一较佳实施例的原理图；图2是实施例中火球菌B型DNA聚合酶基因PF0212的碘酒裂解法基因克隆的菌落PCR结果。图3是火球菌内切核酸酶V的基因定点突变体K61A的构建原理图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1，提供一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，包括步骤为：(1)设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列(寡核苷酸片段)，其中引物序列的特征为：(a)5’端第1-25位间含有间隔性硫代修饰的磷酸二酯键，相邻硫代修饰间相隔3-10碱基；(b)扩增目标基因和质粒载体的正向引物的5’端第1-25位间的碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因和质粒载体的反向引物的5’端第1-25位碱基序列彼此互补配对；(3)3’端下游18-25个碱基序列与待扩增的目标基因和质粒载体的DNA片段两端碱基序列配对。本实施例中目标基因是火球菌B型DNA聚合酶基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：/n(1)用硫代修饰引物扩增目标基因和质粒载体，其中引物序列的特征为：(a)5’端第1-25位间的磷酸二酯键为间隔性硫代修饰，相邻硫代修饰间相隔3-10碱基；(b)扩增目标基因和质粒载体的正向引物的5’端第1-25位间的碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因和质粒载体的反向引物的5’端第1-25位碱基序列彼此互补配对；(c)3’端下游18-25个碱基序列与待扩增的目标基因和质粒载体的DNA片段两端碱基序列配对；/n(2)将目标基因扩增产物和质粒载体扩增产物进行碘酒热处理，在目标基因和线性化载体的硫代修饰处断裂DNA中的磷酸二酯键，断裂后形成的3-10个核苷酸的短链DNA从互补链上脱离，从而在DNA片段的两端产生长度为10-25个核苷酸的3’突出端，单链的长度取决于距离5’端最远的一个硫代修饰距离5’端的距离；/n(3)将热处理后的目标基因DNA片段与质粒载体DNA片段杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；/n(4)所述含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：
(1)用硫代修饰引物扩增目标基因和质粒载体，其中引物序列的特征为：(a)5’端第1-25位间的磷酸二酯键为间隔性硫代修饰，相邻硫代修饰间相隔3-10碱基；(b)扩增目标基因和质粒载体的正向引物的5’端第1-25位间的碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因和质粒载体的反向引物的5’端第1-25位碱基序列彼此互补配对；(c)3’端下游18-25个碱基序列与待扩增的目标基因和质粒载体的DNA片段两端碱基序列配对；
(2)将目标基因扩增产物和质粒载体扩增产物进行碘酒热处理，在目标基因和线性化载体的硫代修饰处断裂DNA中的磷酸二酯键，断裂后形成的3-10个核苷酸的短链DNA从互补链上脱离，从而在DNA片段的两端产生长度为10-25个核苷酸的3’突出端，单链的长度取决于距离5’端最远的一个硫代修饰距离5’端的距离；
(3)将热处理后的目标基因DNA片段与质粒载体DNA片段杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；
(4)所述含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒。


2.根据权利要求1所述的仅基于化学试剂的新型基因克隆方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧，田文齐，
申请(专利权)人：苏州博睐恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32