一种用于检测金葡菌肠毒素sea、seb、sec基因的三重荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测肠毒素基因sea、seb、sec的荧光定量PCR试剂盒，包括含有Premix ExTaq、引物和探针、阳性质粒及灭菌水，其中，引物、探针序列如SEQ ID No.1‑9所示；所述的探针的5’端标记有报告荧光基团，所述的探针的3’端标记有淬灭荧光基团。本发明专利技术还提供了采用上述的试剂盒检测肠毒素基因sea、seb、sec的方法。通过本发明专利技术的试剂盒，可以迅速的检测金葡菌肠毒素基因sea、seb及sec，对肠毒素进行分型，为食物中毒的确诊提供依据。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测金葡菌肠毒素sea、seb、sec基因的三重荧光定量PCR试剂盒
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种试剂盒，具体来说是一种用于检测金葡菌肠毒素sea、seb、sec基因的三重荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
金黄色葡萄球菌肠毒素是一类结构、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，是引起食物中毒的主要因子。据报道，1μg/kg的金葡菌肠毒素便可引起呕吐、腹泻等症状。在《葡萄球菌食物中毒的诊断标准、判定原则和处理原则(WS/T80-1996)》中规定“从中毒食物、患者吐泻物中经培养检出金黄色葡萄球菌，菌株经肠毒素检测证实在不同样品中检出同一型别的肠毒素”，才能判定为肠毒素引起的食物中毒，因此金葡菌肠毒素的分型工作非常重要。对于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测，酶联免疫法是应用较多的检测方法，但是免疫学的方法存在很多缺点。随着分子生物学的发展，渐渐开始使用PCR方法对肠毒素基因进行检测。PCR技术具有灵敏度高、特异性强的优点。目前国内外对于肠毒素基因的检测大多采用普通PCR或荧光定量PCR法逐一检测，缺乏快速高效的多重qPCR方法。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种用于检测金葡菌肠毒素sea、seb、sec基因的三重荧光定量PCR试剂盒，所述的这种用于检测金葡菌肠毒素sea、seb、sec基因的三重荧光定量PCR试剂盒要解决现有技术中检测肠毒素基因的试剂盒时间长、程序繁琐、成本太高，不利于大量样本检测的技术问题。本专利技术提供了一种用于检测肠毒素基因sea、seb、sec的荧光定量PCR试剂盒，包括引物和探针，所述的引物、探针序列如下所示：第一上游引物的序列如SEQIDNo.1所示，第一下游引物的序列如SEQIDNo.2所示，第一探针的序列如SEQIDNo.3所示，第二上游引物的序列如SEQIDNo.4所示，第二下游引物的序列如SEQIDNo.5所示，第二探针的序列如SEQIDNo.6所示，第三上游引物的序列如SEQIDNo.7所示，第三下游引物的序列如SEQIDNo.8所示，第三探针的序列如SEQIDNo.9所示，任意一个所述的探针的5’端标记有报告荧光基团，所述的探针的3’端标记有淬灭荧光基团。进一步的，所述试剂盒还包括PremixExTaq、阳性质粒及灭菌水。本专利技术还提供了上述的试剂盒检测肠毒素基因sea、seb、sec的的方法，包括如下步骤：1)先配制qPCR反应液，在每一个qPCR反应体系中，所述的qPCR反应液的体积为22μL，所述的qPCR反应液包括12.5μL2×浓度的PremixExTaq、1μL的第一上游引物、1μL第一下游引物、0.5μL第一探针、1μL第二上游引物、1μL第二下游引物、0.5μL第二探针、1μL第三上游引物、1μL第三下游引物、0.5μL第三探针、2μL灭菌双蒸水，任意一个引物和探针的浓度均为10μM；2)按照检测样品数n，n＝待检样品数+2，取qPCR反应液于离心管中，置涡旋振荡器上振荡，每管分装22μL，盖上管盖备用；3)将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA3μL加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光定量PCR仪中；4)qPCR反应条件：42℃5min，95℃预变性10s，按以下参数循环40次：95℃2min，95℃15s，55℃20s；55℃时荧光检测，检测通道：FAM，VIC，Cy5；5)结果判定：若Ct值＞35或无数值的标本为阴性；FAM、VIC、Cy5通道Ct值≤30的标本为阳性标本；30＜Ct值＜35的样本建议重做，重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。进一步的，上述检测方法的质控标准如下：(1)阴性对照的Ct值应等于none；(2)阳性对照的Ct值应≤30，否则，此实验视为无效；(3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。通过本专利技术的试剂盒，可以迅速的检测金葡菌肠毒素基因，对肠毒素进行分型，为食物中毒的确诊提供依据。本专利技术通过对用于检测肠毒素基因引物和探针在NCBI的GenBank中进行了Blast验证，证明所设计引物和探针具有良好的特异性，并进行了实样检测，证明了该引物和探针与其他病原没有交叉；另一方面，本专利技术对反应参数进行了优化，验证了其对基因的检测灵敏度。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术的试剂盒只能检测最常见的三种肠毒素基因：肠毒素sea、seb及sec。本专利技术试剂盒对常见的三种金黄色葡萄球菌肠毒素基因的多重荧光定量PCR方法进行研究，具有快速、高效、特异性强的优点。附图说明图1显示了sea质粒的qPCR扩增标准曲线。图2显示了seb质粒的qPCR扩增标准曲线。图3显示了sec质粒的qPCR扩增标准曲线。图4显示了sea的质粒qPCR扩增灵敏度。图5显示了seb的质粒qPCR扩增灵敏度。图6显示了sec的质粒qPCR扩增灵敏度。具体实施方式：实施例11、引物、探针的设计和优化序列来源：通过NCBI基因库检索了金葡菌肠毒素基因sea、seb、sec多个序列，通过序列比对，最终选择了以下三个序列进行引物和探针的设计：sea代表株其登录号为EF520720.1，seb代表株其登录号为KX168632.1；sec代表株其登录号为KX168615.1；sea提取GenBank:EF520720.1。atgaaaaaaacagcatttatactacttttattcattgccctaacgtggacaacaagtccacttgtaaatggtagcgagaaaagcgaagaaataaatgaaaaagatttgcgaaaaaagtctgaattgcagggaacagctttaggcaatcttaaacaaatctattattacaatgaaaaagctaaaactgaaaataaagagagtcacgatcaatttttacagcatactatattgtttaaaggcttttttacaaatcattcatggtataacgatttattagtagattttgattcaaaggatattgttgataaatataaagggaaaaaagtagacttatatggtgcttattatggttatcaatgtgcgggtggtacaccaaacaaaacagcttgcatgtatggtggtgtaacgttacatgataataatcgattgaccgaagagaaaaaagtgccaatcaatttatggctagacggtaaacaaaatacagtacctttggaaacggttaaaacgaataagaaaaatgtaactgttcaggagttggatcttcaagcaagacgttatttacaggaaaaatataatttatataactctga本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测肠毒素基因sea、seb、sec的荧光定量PCR试剂盒，包括引物和探针，其特征在于：所述的引物、探针序列如下所示：/n第一上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，/n第一下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，/n第一探针的序列如SEQ ID No.3所示，/n第二上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，/n第二下游引物的序列如SEQ ID No.5所示，/n第二探针的序列如SEQ ID No.6所示，/n第三上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，/n第三下游引物的序列如SEQ ID No.8所示，/n第三探针的序列如SEQ ID No.9所示，/n任意一个所述的探针的5’端标记有报告荧光基团，所述的探针的3’端标记有淬灭荧光基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肠毒素基因sea、seb、sec的荧光定量PCR试剂盒，包括引物和探针，其特征在于：所述的引物、探针序列如下所示：
第一上游引物的序列如SEQIDNo.1所示，
第一下游引物的序列如SEQIDNo.2所示，
第一探针的序列如SEQIDNo.3所示，
第二上游引物的序列如SEQIDNo.4所示，
第二下游引物的序列如SEQIDNo.5所示，
第二探针的序列如SEQIDNo.6所示，
第三上游引物的序列如SEQIDNo.7所示，
第三下游引物的序列如SEQIDNo.8所示，
第三探针的序列如SEQIDNo.9所示，
任意一个所述的探针的5’端标记有报告荧光基团，所述的探针的3’端标记有淬灭荧光基团。


2.根据就权利要求1所述的一种用于检测肠毒素基因sea、seb、sec的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：还包括PremixExTaq、阳性质粒及灭菌水。


3.采用权利要求1或2所述的试剂盒检测肠毒素基因sea、seb、sec的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)先配制qPCR反应液，在每一个qPCR反应体系中，所述的qPCR反应液的体积为22μL，所述的qPCR反应液包括12.5μL2×浓度的PremixExTaq、1μL的第一上游引物、1μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙冰清，姜芹，张文刚，顾欣，黄士新，商军，吴剑平，张浩然，黄家莺，张妤，
申请(专利权)人：上海市动物疫病预防控制中心上海市兽药饲料检测所，上海市畜牧技术推广中心，
类型：发明
国别省市：上海;31