彩色反转录预混液制造技术

本发明专利技术提供了一种彩色反转录预混液。该预混液中包含了反转录反应除模板外的所有成分，还含有染料。使用本发明专利技术的彩色反转录预混液可以大大简化反转录反应体系的配制步骤，实时追踪反转录以及实时定量PCR反应体系的配制进程，判断其中已经加入了哪些组分，从而大大降低了实验出错的可能，提高了实验检测效率。

Color reverse transcription premix

【技术实现步骤摘要】
彩色反转录预混液
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地涉及一种反转录预混液。
技术介绍
反转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR），是当前检测细胞/组织中基因表达水平的通用方法，使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。在此技术中，mRNA首先在反转录酶作用下合成cDNA；然后以cDNA为模板进行PCR，通过对PCR结果的分析实现对mRNA的检测。在对细胞/组织中基因表达水平进行深入研究时，经常采用反转录-实时定量PCR（real-timePCR）方法。通常，反转录（reversetranscription，RT）的反应体系由以下几种组分组成：1.模板（template）：反转录的模板通常是总RNA或mRNA。目前，随着非编码RNA研究的深入，也有很多研究采用专门纯化的小RNA作为反转录的模板。2.反转录酶（reversetranscriptase）：常用的反转录酶有鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶。3.引物（primer）：反转录常用的引物为Oligo-dT和随机六聚体引物。有的时候为了提高特异性，也会使用特异性引物。4.反应缓冲液：主要成分为镁盐，钾盐，缓冲成分（如Tris-HCl等）和dNTP等。除了上述的几种组分，在配制反转录反应体系时还需要加入适量的水，将反应体系调整至需要的体积。可以说，反转录的反应体系组成是比较复杂的。如果同时用几个模板做反转录，为了使各反应体系尽量一致，通常是先把除了模板的几种组分按照比例混合成一个反转录预混液，然后把配制好的预混液分成几份，再分别加入模板。这个过程需要先进行一定的计算，而且在配制过程中容易出现漏加某种组分的错误。反转录得到cDNA后，常使用实时定量PCR方法对cDNA进行检测。实时定量PCR反应通常使用384孔板或96孔板进行，这样可以同时进行几十至几百个PCR反应，检测多个样品。每个反应体系中都包含几种组分：1.模板：一般是由mRNA或总RNA反转录得来的cDNA。2.引物（primers）和探针（probe）：引物是根据所要检测的模板序列合成的能够跟模板的某一段特异结合的寡核苷酸片段，分为正向引物和反向引物，长度一般在15~25个碱基。实时定量PCR中使用的探针一般是荧光标记的探针，用于探针法实时定量PCR检测。探针设计在两条引物之间，长度比引物略长（一般为20~35碱基）以保证在退火时探针可以先于引物结合在模板上。3.PCR反应预混液（mastermix）：目前商用的实时定量PCR试剂多数是以2×预混液的形式提供，其中包括了PCR反应所需的除模板、引物外的所有成分。除了上述的几种组分，在配制反应体系时还需要加入适量的水，将反应体系调整至需要的体积。这样，一个反应体系需要由3~4种成分混合，完成一块96孔板或384孔板所有反应体系的配制则需要数百上千次的移液操作，工作量很大。由于每种反应组分的量都很少而且都是无色透明的溶液，实验员在操作中很容易发生重复加样或漏加的错误，造成检测的失败。由此可见，反转录-实时定量PCR检测过程中，反转录和实时定量PCR反应体系的配制都存在困难：反转录的反应体系组成比较复杂，配制时常常需要先进行一定的计算，而且在配制过程中容易出现漏加某种组分的错误。实时定量PCR反应体系的配制中很容易发生重复加样或漏加的错误。为了避免这些错误的发生，现在已经有多种含有染料的实时定量PCR试剂可供实验人员选用。但是这些试剂的染料一般都只是预先混合在PCR反应预混液中，可以帮助实验员确认是否已经加入了PCR反应预混液。这对于每个反应体系的三四种成分来说还远远不够。而且，反转录的反应体系配制问题并没有得到有效解决。本专利技术提供的彩色反转录预混液包含了反转录反应除模板外的所有成分，免去了混合多种组分（反转录酶，引物，反应缓冲液）的繁琐操作，使用这种彩色反转录预混液可以方便地进行反转录反应，只需加入模板和水，在42℃反应即可得到cDNA；另外，此反转录预混液中还含有染料，在配制反转录体系的时候，可以通过颜色确认体系中是否已经加入了反转录预混液，降低了出现错误的可能性。反转录得到的cDNA也呈现出鲜艳的颜色。以此cDNA作为实时定量PCR模板，可以帮助实验人员确认模板是否已经正确添加；同时配合含有染料的实时定量PCR反应预混液使用，可以进一步降低反应体系配制时发生错误的可能。
技术实现思路
在做反转录-实时定量PCR检测的时候，反转录和PCR反应体系配制阶段都容易发生错误。本专利技术的目的在于帮助实验人员降低配制反应体系时发生错误的可能。实现的方式是提供了彩色反转录预混液：在配制反转录体系的时候，只需加入模板和水，在42℃反应即可得到cDNA；同时可以通过颜色确认体系中是否已经加入了反转录预混液。使用这种彩色反转录预混液得到的cDNA同样呈现出鲜艳的颜色。实验人员可以通过溶液的颜色很容易地确认PCR反应体系中是否已经加入模板cDNA，避免错误加样。这样，就做到了反转录-实时定量PCR全程的追踪，可以大大降低出现错误的可能性。在实时定量PCR反应预混液中加入染料的方法已经有报道。例如在专利申请“Methodofpreparingareactionmixtureandrelatedproducts（制备反应混合物和相关产品的方法）”（公开号WO2011039425A1）中提到，可以在PCR反应预混液中加入一定浓度的二甲苯青FF，在模板或引物中加入喹啉黄。这样在配制反应体系时，只加入了模板或引物的溶液为黄色，只加入了PCR反应预混液的为蓝色，二者都已加入的为绿色。这样可以根据颜色区分加入了不同组分的反应液。但是这个方法在反应体系中增加了一种试剂（喹啉黄，需要实验人员自行添加到模板或引物中），实际上将反应体系的配制过程变得更加复杂，并没有很好地解决问题，也没有解决反转录体系配制的问题。本专利技术提供了一种彩色反转录预混液。该预混液中包含了反转录反应除模板外的所有成分，免去了混合多种组分（反转录酶，引物，反应缓冲液）的繁琐操作；另外，此反转录预混液中还含有染料。使用这种彩色反转录预混液可以方便地进行反转录反应，只需加入模板和水，在42℃反应即可得到cDNA。在配制反转录体系的时候，可以通过颜色确认体系中是否已经加入了反转录预混液，降低了出现错误的可能性。反转录得到的cDNA也呈现出鲜艳的颜色。以此cDNA作为实时定量PCR模板，可以帮助实验人员确认模板是否已经正确添加。具体实施方式下面结合实施例说明本专利技术的具体实现方法：实施例1，反转录预混液的配制反转录所必需的成分有：反转录酶（MMLV或AMV反转录酶），镁盐（如氯化镁，硫酸镁等），钾盐（氯化钾，硫酸钾等），缓冲成分（如Tris-HCl，Bis-Tris，HEPES，Tricine，TAPS等），dNTP（包括dATP，dTTP，dCTP和dGTP）和引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.彩色反转录预混液，其组成成分包括：反转录酶，镁盐，钾盐，缓冲成分，dNTP，引物和染料。/n

【技术特征摘要】
1.彩色反转录预混液，其组成成分包括：反转录酶，镁盐，钾盐，缓冲成分，dNTP，引物和染料。


2.如权利要求1所述的彩色反转录预混液，其特征在于，所述的染料为酚红，中性红，甲酚红，结晶紫和二甲苯青FF中的一种或几种。


3.如权利要求1所述的彩色反转录预混液，其特征在于，所述的染料浓度在0.001~1g/L。


4.如权利要求1所述的彩色反转录预混液，其特征在于，其中还含有RNA酶抑制剂，甘油，DTT和表面活性剂中的一种或几种。


5.如权利要求1所述的彩色反转录预混液，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓雷，管延斌，袁新旺，
申请(专利权)人：苏州英泽生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32