一种简单快速的DNA现场可视化检测装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种简单快速的DNA现场可视化检测方法及装置，它将装有核酸荧光染料显色反应体系的核酸扩增反应器皿，在核酸扩增反应结束后，在反应器皿不开盖及核酸扩增反应子和核酸荧光染料显色反应体系其它试剂混合均匀的情况下，将反应器皿置于加热环境中，使得在温度为60至80°C进行孵育，消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景荧光信号，用肉眼、摄像设备观察反应器皿内是否透出荧光。本发明专利技术可以实现快速的DNA可视化检测，根据视觉影像直接判断，结果直观，无需采用昂贵的仪器测定和计算及非视觉影像显示所需进行的专业判断，操作人员培训要求低，能适用于诸如肉类等用途广泛的现场DNA检测。

A simple and fast DNA field visual detection device and method

【技术实现步骤摘要】
一种简单快速的DNA现场可视化检测装置和方法
本专利技术属于核酸扩增和检测的领域，其具体内容涉及到一种简单快速的核酸现场可视化检测装置和方法。
技术介绍
随着人口的持续增长，人们每年对畜禽肉品的消费量在持续增大，同时人们对肉类的消费从由原来追求量的满足转向现在追求质的保证。由于牛、羊等动物的饲养成本逐渐提高以及肉质更好，牛肉、羊肉等价格在肉品交易市场中逐年攀升。而猪肉、鸡肉等价格每年基本维持在一个恒定的范围内，同时较牛肉、羊肉等价格低。许多不良商家为了获取暴利，不择手段，非法在高价肉中掺杂低价肉，如在牛肉中掺杂猪肉等。这些行为严重侵害了消费者的权益，危害了消费者的健康。不利于社会经济的平稳健康发展。为了实现对肉种类的鉴别，传统的方法主要是根据外观和形态进行判别，这对于外观相近的肉类很难鉴别出来。为此，研究者们建立了许多其他鉴别方法，如红外光谱分析法、质谱分析法、DNA检测法、色谱分析法、免疫分析法等。其中由于DNA分子非常稳定，每种肉类都有其自身独特的DNA，因此通过检测DNA来鉴别肉的种类是目前最为常用的方法之一。对于检测DNA，一般需要先对DNA进行提取并扩增，再进行检测。因此为了实现对肉类DNA的现场检测，需要在DNA提取、DNA扩增、扩增结果判别等三方面进行一个简化。传统的肉类DNA检测方法在DNA提取与扩增上往往需要消耗2至3小时以上，操作过程较繁琐，操作步骤较多，需要较昂贵的仪器（如PCR扩增仪）等。扩增结果判别一般是利用层析试纸条检测技术或观察荧光扩增曲线来进行判断。前者需要开盖，容易产生假阳性结果；后者需要专业仪器，成本较高。因此，提供一种简单、快速、安全、防污染、低成本的肉类DNA现场可视化检测装置及方法应用于肉类现场鉴别具有重要意义。SYTO9、SYBRGreen等荧光染料由于能够嵌入DNA中产生绿色荧光，常用于核酸扩增反应来对扩增产物进行检测。传统的检测方法是采用专业的大型荧光检测仪器对其进行检测。也有一些研究者利用特定波长的LED光源或紫外灯对其进行激发，利用肉眼进行判别。由于存在环境光的干扰，往往需要在暗室或黑暗的环境下进行观察，才能对阳性与阴性结果进行有效区分。同时由于荧光染料也能够与引物结合产生荧光信号，所以在室温下阴性样品也会产生一定的绿色荧光，使阳性与阴性结果区分不显著，影响结果判断。
技术实现思路
本专利技术首先要解决的技术问题是提供一种能够在普通环境（存在环境光）下的简单快速的DNA现场可视化检测方法。为此，本专利技术采用以下技术方案：一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于，将装有核酸荧光染料显色反应体系的核酸扩增反应器皿，在核酸扩增反应结束后，在反应器皿不开盖及核酸扩增反应子和核酸荧光染料显色反应体系其它试剂混合均匀的情况下，将反应器皿置于加热环境中，使得在温度为60至80°C，优选地，温度为65至80°C，更优选地，温度为65至75°C，更优选地，温度为70至75°C，进行孵育，消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景荧光信号，用肉眼观察反应器皿内是否透出荧光或通过摄像设备观察反应器皿内是否透出荧光和/或对反应器皿拍摄记录。本专利技术再一个要解决的技术问题是提供一种能够在普通环境（存在环境光）下对核酸扩增产物进行可视化检测的装置，能够消除荧光染料与引物结合产生的背景荧光信号影响，并采用常规观察或摄像设备观察和记录。为此，本专利技术采用以下技术方案：一种简单快速的DNA现场可视化检测装置，其特征在于包括箱体，所述箱体设置有温度调节区域及遮光观察区域，所述温度调节区域设置有上述反应器皿的支架，所述箱体中还设置有加热装置，使在所述支架上的反应器皿中的反应液能够在60至80°C的温度下进行检测，所述检测装置还设置有反应器皿的照射光源；所述观察区域设置观察孔，以观察处在温度调节区域的反应器皿，在观察孔和反应器皿所处的位置之间还设置有滤光片；或者，所述观察区中设置有摄像设备，在摄像设备的镜头和反应器皿所处的位置之间还设置有滤光片。所述光源可以为LED光源。所述加热装置设置在温度调节区域中，采用金属电加热发热体为温度调节区域加热。所述加热装置可配置有温控装置，通过传感器监测温度调节区域的温度或加热装置的发热体或反应器皿的温度或反应器皿周围的温度，并据此控制加热装置的工作。所述加热装置可以采用加热铝块，加热铝块直接可作为反应器皿的支架。所述箱体可设置遮光盖，在打开时放入反应器皿，关闭后起到遮光作用，可以有效消除环境光的干扰。所述装置可通过对温度调节区的温度进行调节从而对移至装置内的反应器皿中的扩增反应液再进行加热，使荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物进行分离达到消除背景荧光信号的效果。调节的温度为60至80°C，更优选地，调节的温度为65至80°C，更优选地，调节的温度为65至75°C，更优选地，调节的温度为70至75°C。孵育的时长为5分钟，更优选地，孵育时长为3分钟，更优选地，孵育时长为2分钟。在这些优选的调节温度与孵育时间下，在小于等于1分钟即可对肉类DNA扩增产物等DNA扩增产物进行可视化检测。进一步地，通过温度调节，所述核酸扩增反应也可在对孵育条件下的同一加热环境中进行。本专利技术的可视化检测装置，能够调节加热温度，因此可将该检测装置与核酸恒温扩增反应（如环介导等温扩增反应）结合在一起，无需另外的控温设备，操作简单方便，检测成本低，这对于DNA现场可视化检测具有十分重要的意义。所述检测是将核酸恒温扩增反应与可视化检测整合在一个反应器皿中完成，全程无需开盖。利用温控装置调节加热装置的温度，使得在适宜的反应温度下进行核酸恒温扩增反应。反应结束后，再改变加热装置的温度进行孵育以消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景信号干扰。在结合在一起时，本专利技术的可视化检测装置中的温度调节区域也是核酸扩增反应的场所，所述支架作为核酸扩增反应时的反应器皿支架，所述加热装置作为核酸扩增反应的加热装置。在进行检测时，采用特定波长的LED光源或其他光源对扩增反应液进行照射，经过特定波长的滤光片过滤后，进行可视化观察。优选地，激发波长为460至500nm，更优选地，激发波长为470至490nm，更优选地，激发波长为470至480nm；滤光片透过的波长优选地为520至560nm，更优选地为520至540nm，更优选地为520至530nm。所述可视化检测装置除了能与恒温扩增反应结合外，也可与快速PCR反应（二温区）结合。本专利技术还提供了用于检测肉类DNA的快速PCR反应扩增体系和扩增程序。扩增体系主要考虑DNA聚合酶浓度、引物浓度及荧光染料浓度；扩增程序主要考虑两个温区各自设定的反应温度以及每个循环所需的时间。（1）在检测肉类DNA的快速PCR扩增体系中，DNA聚合酶的浓度范围为8U至25U，优选地，DNA聚合酶的浓度范围为10U至20U，更优选地，DNA聚合酶的浓度范围为10U至15U。（2）在检测肉类DNA的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于，将装有核酸荧光染料显色反应体系的核酸扩增反应器皿，在核酸扩增反应结束后，在反应器皿不开盖及核酸扩增反应子和核酸荧光染料显色反应体系其它试剂混合均匀的情况下，使反应器皿处于加热环境中，使得反应器皿中的反应液体在温度为60至80°C，优选地，温度为65至80°C，更优选地，温度为65至75°C，更优选地，温度为70至75°C，进行孵育，消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景荧光信号，用肉眼观察反应器皿内是否透出荧光或通过摄像设备观察反应器皿内是否透出荧光和/或对反应器皿拍摄记录。/n

【技术特征摘要】
1.一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于，将装有核酸荧光染料显色反应体系的核酸扩增反应器皿，在核酸扩增反应结束后，在反应器皿不开盖及核酸扩增反应子和核酸荧光染料显色反应体系其它试剂混合均匀的情况下，使反应器皿处于加热环境中，使得反应器皿中的反应液体在温度为60至80°C，优选地，温度为65至80°C，更优选地，温度为65至75°C，更优选地，温度为70至75°C，进行孵育，消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景荧光信号，用肉眼观察反应器皿内是否透出荧光或通过摄像设备观察反应器皿内是否透出荧光和/或对反应器皿拍摄记录。


2.如权利要求1所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于在遮光条件下用肉眼观察反应器皿内是否透出荧光或通过摄像设备观察反应器皿内是否透出荧光和/或对反应器皿拍摄记录。


3.如权利要求1所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于所述孵育反应的时间为5分钟，更优选地，反应时长为3分钟，更优选地，反应时长为2分钟。


4.如权利要求1所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于在进行孵育之前，所述核酸扩增反应也在同一加热环境中进行。


5...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，伍辉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33