一种TNT∕IL-4∕G纳米生物材料的性能评估方法技术

本发明专利技术提供一种TNT/IL‑4/G纳米生物材料的性能评估方法，将该TNT/IL‑4/G纳米生物材料用于对巨噬细胞表型转换中进行，通过巨噬细胞在TNT/IL‑4/G纳米生物材料表面的极化，及体外抗凝抗血测定来评估其性能。与TI、TNT及TNT/H相比，TNT/IL‑4/G纳米生物材更能促进巨噬细胞M2极化，使得巨噬细胞M2相关基因表达上调，炎症因子释放减少，达到抗炎的目的，使得巨噬细胞M2细胞释放的血管内皮生长因子增多，从而加速内皮化，减少血栓形成，同时，释放的肝素直接作用血小板，也表现出高效的抗凝效率，达到减少血栓形成的目的。

Performance evaluation method of TNT / IL-4 / g nano biomaterials

【技术实现步骤摘要】
一种TNT/IL-4/G纳米生物材料的性能评估方法
本专利技术涉及抗凝抗血生物材料
，特别涉及一种TNT/IL-4/G纳米生物材料的性能评估方法。
技术介绍
钛广泛用于各种血液接触材料和装置，例如血栓过滤器和人造心脏瓣膜，在钛具有有限的生物相容性的基础上，用阳极氧化法制备得到表面有纳米管阵列的二氧化钛纳米管，增加了材料本身的亲水性(通常亲水性越高，防止血栓形成的作用越显著)，也因其比表面积，管径以及长度，可使更多的细胞黏附在材料表面，从而植入物生物相容性有了质的提升。因此，通过表面修饰将钛转化为二氧化钛成为种植体材料的研究热点。然而随着研究的深入，单纯的二氧化钛纳米管已经无法达到预期调节炎症的效果。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的是提供一种TNT/IL-4/G纳米生物材料的性能评估方法，以验证其能够达到更好的调节炎症效果。一种TNT/IL-4/G纳米生物材料的性能评估方法，通过将该TNT/IL-4/G纳米生物材料用于对巨噬细胞表型转换中进行，该性能评估方法的步骤包括：步骤S100，在预设温度将TNT/IL-4/G纳米生物材料浸泡在磷酸盐缓冲液中，并在不同时间点进行震荡后收集浸泡后的磷酸盐缓冲液，分别检测肝素和IL-4的释放量，以确定肝素和IL-4能够持续稳定释放；步骤S200，将小鼠的巨噬细胞分别种植在TI、TNT、TNT/H及TNT/IL-4/G纳米生物材料的表面进行刺激后形成TI样品、TNT样品、TNT/H样品及TNT/IL-4/G样品，在不同时间点对各样品中的巨噬细胞M1和巨噬细胞M2的相关基因表达进行RT-PCR分析，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2相关基因的表达及抑制巨噬细胞M1相关基因的表达；步骤S300，提取处理后的各样品中的上清液来检测巨噬细胞M1和巨噬细胞M2分泌的炎症因子的浓度，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2的表达；步骤S400，提取培养后的小鼠内皮细胞，分别加入各样品对应的条件培养基进行培养，并在不同时间点检测各组中小鼠内皮细胞的内皮化率，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料更能促进巨噬细胞M2的表达；步骤S500，向单独加入各样品的磷酸盐缓冲液中，分别加入含有柠檬酸钠的新西兰兔血液进行孵育后，进行抗凝及抗血小板实验，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料具有更优的抗凝及抗血效率；步骤S600，将单独植入TI、TNT、TNT/H及TNT/IL-4/G纳米生物材的不同小鼠进行饲养预设时间后取出各材料，分别进行HE染色和CD31免疫组化染色，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料更能促进新生血管的生成。相较现有技术，本专利技术通过巨噬细胞在TNT/IL-4/G纳米生物材料表面的极化，及体外抗凝抗血测定来评估其性能。与TI、TNT及TNT/H相比，TNT/IL-4/G纳米生物材更能促进巨噬细胞M2极化，使得巨噬细胞M2相关基因表达上调，炎症因子释放减少，达到抗炎的目的，使得巨噬细胞M2细胞释放的血管内皮生长因子增多，从而加速内皮化，减少血栓形成。同时，释放的肝素直接作用血小板，也表现出高效的抗凝效率，达到减少血栓形成的目的。进一步地，在步骤S100中，所述预设温度为37℃，不同时间点分别为12h、1d、2d、3d、5d、7d、11d；通过酶联免疫吸附测定法来检测IL-4的释放量，通过肝素钠试剂来检测肝素的释放量；在3d内，肝素和IL-4的释放效率均达到最高。进一步地，所述步骤S200具体包括：步骤S201，将小鼠的巨噬细胞分别种植在TI、TNT、TNT/H及TNT/IL-4/G纳米生物材料的表面进行刺激后形成TI样品、TNT样品、TNT/H样品及TNT/IL-4/G样品；步骤S202，提取各样品中的总RNA进行逆转录形成DNA，并进行基因扩增；步骤S203，在1d、3d、5d、7d后分别检测各样品中的巨噬细胞M1相关基因IL-1、IL-6及INOS的表达，及巨噬细胞M2相关基因ARG、CD206及IL-10的表达；步骤S204，确定在TNT/IL-4/G样品中，巨噬细胞M2相关基因ARG、CD206及IL-10的表达上调，巨噬细胞M1相关基因IL-1、IL-6及INOS的表达下降，即TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2相关基因的表达及抑制巨噬细胞M1相关基因的表达。进一步地，所述步骤S300具体包括：步骤S301，将标准品和各样品分别加入浸泡后不同培养皿中；步骤S302，在室温下加入特异性一抗进行孵育一段时间后，采用磷酸盐吐温缓冲液进行洗涤；步骤S303，向各培养皿中加入抗辣根过氧化物酶进行培养后，依次加入着色溶液和终止溶液；步骤S304，提取各培养皿中的上清液，采用滤波器检测巨噬细胞M1分泌的炎症因子IL-1、IL-6及TNF-α，巨噬细胞M2分泌的炎症因子IL-10；步骤S305，确定在TNT/IL-4/G样品中，巨噬细胞M2分泌的炎症因子IL-10的浓度高，巨噬细胞M1分泌的炎症因子IL-1、IL-6及TNF-α的浓度低，即TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2的表达。进一步地，特异性一抗为比例为1/100的稀释液，室温孵育时间为1.5h，洗涤次数为6次，抗辣根过氧化物酶的培养时间为30min，滤波器为刷选波长为450nm。进一步地，所述步骤S400具体包括：步骤S401，将划痕处理的小鼠内皮细胞接种在不同的培养皿中，在小鼠内皮细胞覆盖培养皿时，吸取各培养皿中的原始培养基，并向各培养皿中单独加入各样品对应的条件培养基进行培养，在不同的时间点观察各培养皿中小鼠内皮细胞的愈合情况；步骤S402，向不同的培养皿中加入等量的基质凝胶，在各培养皿中的基质凝胶固化后，向各培养皿中单独加入TI样品、TNT样品、TNT/H样品及TNT/IL-4/G样品进行培养，并观察各培养皿中新管形成的数量以及总管长；步骤S403，向不同的培养皿中加入等量的基质凝胶，在各培养皿中的基质凝胶固化后，向各培养皿中单独加入TI样品、TNT样品、TNT/H样品及TNT/IL-4/G样品进行培养，在不同时间点向各培养皿中分别加入CCK8溶液进行温育后，用酶标仪读取各培养皿在450nm处的吸光度以测定细胞的增殖情况；步骤S404，确定小鼠内皮细胞在TNT/IL-4/G样品中的内皮化率最佳，即TNT/IL-4/G纳米生物材料更能促进巨噬细胞M2的表达。进一步地，在步骤S401中，分别在0h、6h及12h观察各培养皿中小鼠内皮细胞的愈合情况；在步骤S402中，将含有基质凝胶的不同的培养皿置于37℃的培养箱中进行固化30min，再加入各样品后进行培养6h；在步骤S403中，CCK8溶液的量为0.5mL，在37℃条件下温育3.5h。进一步地，所述步骤S500具体包括：步骤S501，向单独加入各样品的磷酸盐缓冲液中，分别加入含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TNT/IL-4/G纳米生物材料的性能评估方法，其特征在于，通过将该TNT/IL-4/G纳米生物材料用于对巨噬细胞表型转换中进行，该性能评估方法的步骤包括：/n步骤S100，在预设温度将TNT/IL-4/G纳米生物材料浸泡在磷酸盐缓冲液中，并在不同时间点进行震荡后收集浸泡后的磷酸盐缓冲液，分别检测肝素和IL-4的释放量，以确定肝素和IL-4能够持续稳定释放；/n步骤S200，将小鼠的巨噬细胞分别种植在TI、TNT、TNT/H及TNT/IL-4/G纳米生物材料的表面进行刺激后形成TI样品、TNT样品、TNT/H样品及TNT/IL-4/G样品，在不同时间点对各样品中的巨噬细胞M1和巨噬细胞M2的相关基因表达进行RT-PCR分析，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2相关基因的表达及抑制巨噬细胞M1相关基因的表达；/n步骤S300，提取处理后的各样品中的上清液来检测巨噬细胞M1和巨噬细胞M2分泌的炎症因子的浓度，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2的表达；/n步骤S400，提取培养后的小鼠内皮细胞，分别加入各样品对应的条件培养基进行培养，并在不同时间点检测各组中小鼠内皮细胞的内皮化率，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料更能促进巨噬细胞M2的表达；/n步骤S500，向单独加入各样品的磷酸盐缓冲液中，分别加入含有柠檬酸钠的新西兰兔血液进行孵育后，进行抗凝及抗血小板实验，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料具有更优的抗凝及抗血效率；/n步骤S600，将单独植入TI、TNT、TNT/H及TNT/IL-4/G纳米生物材的不同小鼠进行饲养预设时间后取出各材料，分别进行HE染色和CD31免疫组化染色，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料更能促进新生血管的生成。/n...

【技术特征摘要】
1.一种TNT/IL-4/G纳米生物材料的性能评估方法，其特征在于，通过将该TNT/IL-4/G纳米生物材料用于对巨噬细胞表型转换中进行，该性能评估方法的步骤包括：
步骤S100，在预设温度将TNT/IL-4/G纳米生物材料浸泡在磷酸盐缓冲液中，并在不同时间点进行震荡后收集浸泡后的磷酸盐缓冲液，分别检测肝素和IL-4的释放量，以确定肝素和IL-4能够持续稳定释放；
步骤S200，将小鼠的巨噬细胞分别种植在TI、TNT、TNT/H及TNT/IL-4/G纳米生物材料的表面进行刺激后形成TI样品、TNT样品、TNT/H样品及TNT/IL-4/G样品，在不同时间点对各样品中的巨噬细胞M1和巨噬细胞M2的相关基因表达进行RT-PCR分析，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2相关基因的表达及抑制巨噬细胞M1相关基因的表达；
步骤S300，提取处理后的各样品中的上清液来检测巨噬细胞M1和巨噬细胞M2分泌的炎症因子的浓度，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2的表达；
步骤S400，提取培养后的小鼠内皮细胞，分别加入各样品对应的条件培养基进行培养，并在不同时间点检测各组中小鼠内皮细胞的内皮化率，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料更能促进巨噬细胞M2的表达；
步骤S500，向单独加入各样品的磷酸盐缓冲液中，分别加入含有柠檬酸钠的新西兰兔血液进行孵育后，进行抗凝及抗血小板实验，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料具有更优的抗凝及抗血效率；
步骤S600，将单独植入TI、TNT、TNT/H及TNT/IL-4/G纳米生物材的不同小鼠进行饲养预设时间后取出各材料，分别进行HE染色和CD31免疫组化染色，以确定TNT/IL-4/G纳米生物材料更能促进新生血管的生成。


2.根据权利要求1所述的TNT/IL-4/G纳米生物材料的性能评估方法，其特征在于，在步骤S100中，所述预设温度为37℃，不同时间点分别为12h、1d、2d、3d、5d、7d、11d；
通过酶联免疫吸附测定法来检测IL-4的释放量，通过肝素钠试剂来检测肝素的释放量；
在3d内，肝素和IL-4的释放效率均达到最高。


3.根据权利要求1所述的TNT/IL-4/G纳米生物材料的性能评估方法，其特征在于，所述步骤S200具体包括：
步骤S201，将小鼠的巨噬细胞分别种植在TI、TNT、TNT/H及TNT/IL-4/G纳米生物材料的表面进行刺激后形成TI样品、TNT样品、TNT/H样品及TNT/IL-4/G样品；
步骤S202，提取各样品中的总RNA进行逆转录形成DNA，并进行基因扩增；
步骤S203，在1d、3d、5d、7d后分别检测各样品中的巨噬细胞M1相关基因IL-1、IL-6及INOS的表达，及巨噬细胞M2相关基因ARG、CD206及IL-10的表达；
步骤S204，确定在TNT/IL-4/G样品中，巨噬细胞M2相关基因ARG、CD206及IL-10的表达上调，巨噬细胞M1相关基因IL-1、IL-6及INOS的表达下降，即TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2相关基因的表达及抑制巨噬细胞M1相关基因的表达。


4.根据权利要求1所述的TNT/IL-4/G纳米生物材料的性能评估方法，其特征在于，所述步骤S300具体包括：
步骤S301，将标准品和各样品分别加入浸泡后不同培养皿中；
步骤S302，在室温下加入特异性一抗进行孵育一段时间后，采用磷酸盐吐温缓冲液进行洗涤；
步骤S303，向各培养皿中加入抗辣根过氧化物酶进行培养后，依次加入着色溶液和终止溶液；
步骤S304，提取各培养皿中的上清液，采用滤波器检测巨噬细胞M1分泌的炎症因子IL-1、IL-6及TNF-α，巨噬细胞M2分泌的炎症因子IL-10；
步骤S305，确定在TNT/IL-4/G样品中，巨噬细胞M2分泌的炎症因子IL-10的浓度高，巨噬细胞M1分泌的炎症因子IL-1、IL-6及TNF-α的浓度低，即TNT/IL-4/G纳米生物材料促进巨噬细胞M2的表达。


5.根据权利要求4所述的TNT/IL-4/...

【专利技术属性】
技术研发人员：周建良，丁静丽，余文朋，芦潮，聂彬恩，刘新粮，朱国栋，林峰，刘季春，徐建军，唐燕华，董啸，
申请(专利权)人：南昌大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：江西;36