一种甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法及试剂盒，涉及基因工程技术领域，检测：从检测样本中提取总RNA或mRNA；对样本总RNA或mRNA进行逆转录获得cDNA后，分别用融合基因靶点特异PCR扩增引物进行融合基因靶点特异性PCR扩增；对特异性PCR扩增产物进行电泳检测，得出扩增产物片段种类及大小；根据电泳结果，判定样本基因中是否含有甲状腺癌相关基因融合突变。本发明专利技术提供的方法可以从RNA水平对甲状腺癌中这三种最常见的基因融合进行简便、快速地检测，方法灵敏度高，适用于临床。

【技术实现步骤摘要】
一种甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法及试剂盒
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法及试剂盒。
技术介绍
甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，近年来，其发病率持续且急剧增加。及时准确地鉴定甲状腺癌十分必要。临床数据统计显示，普通人群中通过超声检查对甲状腺结节的检出率约为35％，最终这些结节中80-95％被鉴定为良性结节，仅有5％～15％的结节为恶性结节，即甲状腺癌。因此，必须对甲状腺结节良恶性进行进一步辨别。超声引导下的细针穿刺活检可以确保对甲状腺病变进行术前诊断。但是，在20–30％的结节抽吸物中，细胞学检查结果为“不确定”，恶性肿瘤的风险范围为5％至75％。由于缺乏准确灵敏的诊断手段，检查结果为“不确定”的患者需通过术后病理检测以明确诊断，从而对患者造成不必要的伤害。然而如果对这类无法明确诊断的结节进行保守治疗，又存在恶性肿瘤扩散和转移的巨大风险。为了解决诊断缺陷并改善治疗方法，新的方法，例如对基因突变，miRNA和基因表达谱等分子标记物的检测，等方法正在逐渐被开发出来。美国2017年NCCN临床实践指南指出细胞学无法明确诊断的甲状腺结节可利用分子诊断判断良性/恶性。指南指出RET/PTC、PAX8/PPARg融合癌基因的变异检测对辅助诊断甲状腺癌具有重要作用。基因融合已被认为是不同类型癌症中的重要驱动因素，并被认为是抗癌治疗中的潜在诊断标志物或治疗靶标。对不同癌症中致癌融合基因的检出在临床中十分重要。甲状腺癌中基因融合的情况与其组织学亚型相关。散发性乳头状甲状腺癌(PTC)病例中约有6–46％会发现致癌融合。在TCGA数据研究中，发现484个PTC中有15.3％发生了基因融合。RET融合(称为RET/PTC重排)是PTC中最常见的重排。在散发性PTC中，RET/PTC的患病率范围为10％至30％，而在儿童和青少年中散发性PTC的发生率更高，最高为45–60％。辐射诱发的PTC的特征还在于RET/PTC融合的频率很高，占病例的35％至50-80％。主要的RET/PTC融合是CCDC6-RET(RET/PTC1)和NCOA4-RET(RET/PTC3)，它们总共占所有RET/PTC重排的90％。而PAX8-PPARG重排几乎完全在FTC中发现(在FTC中为30-60％)。致癌融合是通过平衡和不平衡的染色体重组产生的，例如染色体区段的易位，插入，倒位和缺失。鞘磷脂是另一种可能的融合发生机制，其特征是同时发生多个重排。内含子区域的重组导致完整的外显子类型以转录物断点为特征的融合转录物恰好位于外显子的边界。相反，在断裂的外显子类型的转录本中，断点可以位于外显子的中间。另外，可以通过反式或顺式剪接在转录水平上形成融合转录本。基因融合的结果是表达，功能，亚细胞定位或强迫寡聚化改变的新型嵌合蛋白。传统对基因重排的检测方法包括染色体显带，荧光原位杂交等技术，然而这些技术费时费力，且检测分辨率较低。近些年出现的芯片和二代测序技术可以大批量检测基因重排，且具有很高的分辨率，然而成本较高，且检测周期较长。
技术实现思路
为解决基因重排的传统检测方法带来的上述问题，本专利技术提供一种新的甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法及试剂盒。首选，本专利技术提供一种新的甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法，包括以下步骤：(1)从检测样本中提取总RNA或mRNA；(2)对样本总RNA或mRNA进行逆转录获得cDNA后，分别用融合基因靶点特异PCR扩增引物进行融合基因靶点特异性PCR扩增；(3)对特异性PCR扩增产物进行电泳检测，得出扩增产物片段种类及大小；(4)根据电泳结果，判定样本基因中是否含有甲状腺癌相关基因融合突变。所述甲状腺癌相关基因融合突变包括RET/PTC1融合、RET/PTC3融合及PAX8-PPARG重排。优选地，上述步骤(1)中所述检测样本为待检测病人身体组织，病人身体组织可以为新鲜、冰冻或石蜡包埋的细针穿刺样本或手术组织样本。优选地，组织总RNA的提取可以使用市面销售的总RNA提取产品，如：Qiagen公司RNeasyMiniKit或RNeasyFFPEKit等。优选地，上述步骤(2)所述逆转录，逆转录酶可以选择市面销售的逆转录酶产品，如ThermoFisher公司的SuperScriptTMIVReverseTranscriptase或其他类似产品；逆转录引物可以采用Oligo(dT)或随机引物，更优选随机引物进行逆转录，可以获得更高的检测灵敏度；融合基因靶点特异性PCR可使用市面销售的热激活DNA聚合酶及相应反应混合液，如Invitrogen公司产品2xPlatinumSuperFiIIPCR反应混合液或其他类似产品。优选地，上述步骤(2)所述逆转录及融合位点特异性PCR扩增还可使用一步法RT-PCR进行，一步法RT-PCR可以选择市面销售的一步法RT-PCR试剂盒，如ThermoFisher公司的SuperScriptTMIVOne-StepRT-PCRSystem或其他类似产品。上述步骤(2)所述融合位点特异性PCR的融合基因靶点及内部参照物靶点对应的特异PCR扩增引物序列见SEQIDNO.1-SEQIDNO.12，特异性PCR扩增产物片段大小见表1，其中针对RET/PTC1融合有一对引物组合，针对RET/PTC3融合有一对引物组合，而针对PAX8-PPARG重排，由于其DNA融合位点可能发生在PAX8基因的8号，9号或10号内含子区，因此相应设计了三组检测引物组合。此外，设计了一对引物对ActinBeta基因进行扩增作为扩增反应内部参照。表1.优选地，上述步骤(3)所述电泳检测，检测方法可采用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等方法。电泳系统优选使用Agilent公司的TapeStationSystem，可以更方便、准确地检出扩增产物片段大小。上述步骤(4)所述判定，方法为：1)当ActinBeta内参基因扩增产物电泳结果不包含片段大小为172bp的扩增产物片段时，则判定步骤(2)～(3)有误，电泳结果不能作为判定标准，需重复步骤(2)～(3)；当电泳结果包含片段大小为172bp的扩增产物片段时，继续进行步骤2)的判断；2)当RET/PAC1融合靶点扩增产物电泳结果含66bp大小片段时，判定样本基因中含有RET/PAC1融合突变；当RET/PAC3融合靶点扩增产物电泳结果含73bp大小片段时，判定样本基因中含有RET/PAC3融合突变；当PAX8-PPARG重排靶点引物对a有66bp扩增产物，或PAX8-PPARG重排靶点引物对b有74bp扩增产物，或PAX8-PPARG重排靶点引物对c有74bp扩增产物时，判定样本基因中含有PAX8-PPARG融合突变；当各靶点扩增产物电泳结果均不包含上述扩增产物片段时，判定样本基因中不含有所述甲状腺癌相关基因融合突变中的任何一种。优选地，可同时设立阴性对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)从检测样本中提取总RNA或mRNA；/n(2)对样本总RNA或mRNA进行逆转录获得cDNA后，分别用融合基因靶点特异PCR扩增引物进行融合基因靶点特异性PCR扩增；/n(3)对特异性PCR扩增产物进行电泳检测，得出扩增产物片段种类及大小；/n(4)根据电泳结果，判定样本基因中是否含有甲状腺癌相关基因融合突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)从检测样本中提取总RNA或mRNA；
(2)对样本总RNA或mRNA进行逆转录获得cDNA后，分别用融合基因靶点特异PCR扩增引物进行融合基因靶点特异性PCR扩增；
(3)对特异性PCR扩增产物进行电泳检测，得出扩增产物片段种类及大小；
(4)根据电泳结果，判定样本基因中是否含有甲状腺癌相关基因融合突变。


2.根据权利要求1所述的甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法，其特征在于：所述甲状腺癌相关基因融合突变包括RET/PTC1融合、RET/PTC3融合及PAX8-PPARG重排。


3.根据权利要求2所述的甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述检测样本为待检测病人身体组织，病人身体组织可以为新鲜、冰冻或石蜡包埋的细针穿刺样本或手术组织样本。


4.根据权利要求2所述的甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法，其特征在于：步骤(2)所述融合位点特异性PCR的融合基因靶点及内部参照物靶点对应的特异PCR扩增引物序列如下：
其中，RET/PTC1融合靶点引物对为F:GACCTGCGCAAAGCCAG(SEQIDNO.1)，R:AACCAAGTTCTTCCGAGGGA(SEQIDNO.2)；RET/PTC3融合靶点引物对为F:GCTTACCCAAAAGCAGACCTT(SEQIDNO.3)，R:AACCAAGTTCTTCCGAGGGA(SEQIDNO.4)；PAX8-PPARG重排靶点引物对有a、F:ACCTCTCGACTCACCAGAC(SEQIDNO.5)，R:ATGGCATCTCTGTGTCAACCA(SEQIDNO.6)，b、F:CTCCGTGTACGGGCAGTT(SEQIDNO.7)，R:AGAATGGCATCTCTGTGTCAACC(SEQIDNO.8)，c、F:CAGCTATGCCTCCTCTGCC(SEQIDNO.9)，R:GCCAGAATGGCATCTCTGTG(SEQIDNO.10)；内部参照物靶点为ActinBeta内参基因，引物对为F:AGCTCACCATGGATGATGATATCGC(SEQIDNO.11)，R:CCCACATAGGAATCCTTCTGACC(SEQIDNO.12)。


5.根据权利要求2所述的甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法，其特征在于：步骤(4)所述判定，方法为：
1)当ActinBeta内参基因扩增产物电泳结果不包含片段大小为172bp的扩增产物片段时，则判定步骤(2)～(3)有误，电泳结果不能作为判定标准，需重复步骤(2)～(3)；当电泳结果包含片段大小为172bp的扩增产物片段时，继续进行步骤2)的判断；
2)当RET/PAC1融合靶点扩增产物电泳结果含66bp大小片段时，判定样本基因中含有RET/PAC1融合突变；当RET/PAC3融合靶点扩增产物电泳结果含73bp大小片段时，判定样本基因中含有RET/PAC3融合突变；当PAX8-PPARG重排靶点引物对a有66bp扩增产物，或PAX8-PPARG重排靶点引物对b有74bp扩增产物，或PAX8-PPARG重排靶点引物对c有74bp扩增产物时，判定样本基因中含有PAX8-PPARG融合突变；
当各靶点扩增产...

【专利技术属性】
技术研发人员：余涛，金泰庆，万季，宋麒，
申请(专利权)人：深圳市新合生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44